1、密度梯度離心基礎余興明中科院上海生物化學研究所概論轉頭選擇密度梯度選用一、概論在密度梯度離心中單一樣品組份的分離是借助于混合樣品穿過密度梯度層的沉降或上浮來達到的。梯度液的密度隨著離心本經的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在離心過程中自形成，經常，密度梯度的可以分為：速率一區帶（Rate-30nal）離和等密度（Isopycnic）離心。在速率一區帶離心中混合樣品的以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于不同組份"顆粒"在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時刻形成了數個含左第一級份顆粒的"區帶”。離心過程在最垂"的樣品（或者說沉降得最快的

2、樣品）形成沉殿前就停止了。樣品在離心后與梯度液一起收集，用常規技術去除梯度材料后就得了某個較純的成份。每個單一組份的沉降速率取決于它們的形狀、尺寸、密度、離心力的大小、梯度液的密度和粘性系數。對于相類似的生物體組份常常形狀也相似。在速率區帶離心中我們常常使梯度液的最大密度不超過樣品在該梯度中浮密度。利用這類生物組份在尺寸上的差異的形成的沉降速率的不同，選擇某一特定時刻，當它們中的各個純樣品區帶之間的距離拉得最遠時停止離心即可以達到分離目的。與速率一區帶離心法不同的是，等密度離心是依賴于樣品顆粒的不同密度來進行離心分離的?；旌蠘悠房梢凿佋谔荻纫褐希部梢灾糜谔荻纫褐拢踔梁吞荻纫夯煸谝黄?。最

3、后一種方法依靠離心力來形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的過程中由于樣品各單一成份向它們自己的等密度區靠擾即達到了分離純化的目的。對于速率一區帶離心，梯度液最大密度一般小于樣品中各組份的密度，也就是說是在樣品正在沉降過程中的不是在形成沉殿后來分離樣品；而等密度離心法中，梯度液的初始最大密度常常超過樣品各組份的密度，利用每個單一組份沉降或上浮到它們各自的等密度區來達到分離的目的。密度梯度離心法的理論依據是（參考文獻1）每種純樣品成份在梯度液中的沉降速度可以表達為：V=d2+18X（-s）+4X32r式中V是某一時刻樣品的沉降速度（厘米/秒）d：樣品顆粒的直徑（厘米），我們在初步計算時就假說樣品顆粒

4、為球體。非球形顆粒樣品，可以以上式為基礎進行修正。b:樣品顆粒的密度（克/厘米3）s：密度梯度液的密度（克/厘米3）鳥：密度梯度液的粘性系數（克/厘米秒）：離心機重軸的旋轉角速度（1/秒），=2兀N+60,N:轉/分r：顆粒所在位置與旋轉軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）當b此時V>0即樣品順離心力方向沉降bS時V0即樣品逆離心力方向上浮b=S時V=0即樣品停止沉降或上浮，"穩定"在這一位置用這個公式可以很好地解釋在速率一區帶離心法或等密度離心法中單一樣品的沉降（或上?。┬袨?。二、轉頭的選擇：1、離心轉頭分類：轉頭類別使用的離心機發明時間、發明者或推廣商囿定角式轉頭低

5、、高、超速1943年，（英）Pickels甩平轉頭低、高、超速1951年，（德）Kahler垂直管轉頭高、超速1974-1975年，（美）Dupont公司區帶轉頭低、高、超速1964-1965年，（英）Anderson、（英）MSE公司近垂直管轉頭超速1989年，（日）HitachiKoki、（美）Beckman公司連續離心轉頭低、高、超速1965年，（英）MSE公司其他特種轉頭：分析轉頭，土壤脫水轉頭，細胞浮選轉頭，管式轉頭，血球比測定轉頭，細胞清洗轉頭等等。2、各種轉頭用于密度梯度離心的比較：（I）各種轉頭用于速率一區帶（R-z）離心的優缺點分析：固定角式轉頭：壁部放應影響很大，用于R-z

6、離心回、收率低，純度也受影響一般知用于差分離心和等密度離心，離心時間向較短。是各其離心機的最高速轉頭。甩平轉頭：細長離心管用于R-z離心可以獲得較高純度和高分辨率，且容易控制離心時間，壁部入在很少。25000rpm30000rpm的甩平轉頭最適用于亞細胞器的離心分離，而4000042000rpm的甩平轉頭適合用于核酸、蛋白、病毒草類物質內流的分離。離心時間較長。垂直管轉頭：沉降距離最短，因而離心分離時間也是短。最大半徑前幾乎沒有壁部放位，最大本徑后右一定壁部效位，垂直剖面積較大，因而離心后純樣品區帶的容量也較大。但在有沉殿的密度梯度離心中，沉淀和浮動區帶方向轉換之間存在干擾，可能影響純樣品區帶

7、的純度。大部份R-z離心沒有沉殿，垂直管轉頭很適合做R-z離心。近垂直管轉頭：管軸線與旋轉主軸之間傾角7度9度（角式轉頭20度45度）沉降距離比垂直轉頭稍大，離心時間比角式，甩平轉頭都要短。由于右了傾角，沉殿可沿管壁滑向低部，因此基本上清除了沉殿與浮動區帶轉換之間的干擾，適合做R-z離心，特別適合做生物大分子（如質粒DNA）的自形成梯度等密度離心。區帶轉頭：沒有壁部入應特別適合做大容量的病毒，亞細胞器，生物大分子的R-z離心，可用于研究，中試和少批量生產。分離純度高，量大，但操作要求高，轉頭及整體價格昂貴。連續流離心轉頭：工作原理的區帶轉頭相似，可連續工作，分離量大，分離統純度高，可用于各種生

8、物體的差分，R-z等密度離心。近年來高速連續流轉頭常用于大量發酵液（大腸樣菌、醞母菌）菌體的沉殿。（II）各種轉頭用于等密度離心內優缺點分析：固定角式轉頭：主要用于差分離心的角式轉頭，在速離心機上可以很好地用于等密度離心，尤其是DNA平衡等密度離心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的單管的容量為1015ml,常用轉速4000060000rpm,離心時間較短，分離純度也較高。甩平轉頭：用作等密度離心時，壁部效應對分離效果影響較少，梯度變換在甩平時自然過渡因而很適合做等密度離心實驗，優點是回收率高，分辨能力強。缺點是沉降距離長，最高轉速較低（由于結構層固此類轉頭最主轉速一般在60000rpm

9、以下）因而，離心時間很長，對某些長離心管，1015ml容量的轉頭最高轉速在4000041000rpm，用作自形成CSCL梯度的質粒DNA離心往往需要5070小時。垂直管轉頭：適合作等密度離心，沉降距離最短，在沒有沉殿或沉殿非常堅實的情況下，對于現代可自由選擇加速、減速時間的離心機，梯度轉換得很好。這類轉頭轉進很高（目前最高轉速可達100000rpm,70000xg）離心時間最短，分離純度高，樣品容量較大（垂直剖面積最大）。近垂直轉頭：九十年代以后開始使用的新型轉頭，用作生物大分子（DNA,RNA,蛋白質等）的平衡等密度離心最佳，目前這類轉頭的最高轉速已達90000rpm近650000xg），離

10、心時間相比垂直轉頭稍長。區帶轉頭：非常適合做大容量樣品的等密度離心連續流離心轉頭：高、低速連續流轉頭一般不用作密度梯度離心超速連續流轉頭適合做大容量樣品的等密度離心分離。（三）密度梯度-材料和梯度型式的選用1、對于速率-區帶密度梯度離心，梯心度選擇要點（I）概述：用速率一區帶法下簡移尺R-z法進行分離的主要原理是依靠不同樣品在梯度中沉降速率的不同來分離（比化樣品，因此希望樣品在沉降能通過整個離心管長度的提高分辨率。作為最基本條件就是梯度液的最大密度必須少于樣品顆粒的密度。用有密度梯度的支持液作R-z離心有以下優點：*當樣品中不同組份分層進入梯度液時，梯度的較高密度支持著樣品這樣就使樣品各個不同

11、密度的層次以較窄（或較薄）的區帶沉降從而得到期較高的分辨率（或較高的純度）*梯度液的密度一般是從離心管上部到底部逐漸增加，這樣就可以穩定液栓，提示抗對和抗機械擾動的能力（接近離心過程結束時，純樣品區帶和它的支持液的密度差較少）*梯度液粘性系數逐漸增大也使純樣品區帶變窄從而提示了分辨率而逐漸減緩的沉降速度使同一組份樣品逐漸靠擾，提高了分離純度。（II）梯度、材料的選用一個理想的梯液就具備：化學穩定性好；高溶合度；低滲透性；在溶劑中穩定性；較低的光吸收特性;價廉等。遺憾的是很難找到一種適合于各種R-z離心的完美無缺的梯度液。對于大參數R-z離心，蔗糖是比較合適的梯度材料。盡管它在高密度（30%W/

12、N）時粘性每數較大,但綜合比較表明它可以廣泛應用。但由于蔗糖在各種密度時（即使是低密度時也如此）右較高的滲透性，分離一些對滲透性敏感的生物體組份時需要選擇其他梯度材料，如由pharmacia公司開發的Ficoll等等。在大多數情況下，梯度液的PH值應與被分離時生物樣品的生理PH值一致。對密度梯度材料的基本要求：a）能夠配制所需要的密度范圍b）粘性系數較低c）溶合度高d）有密度與光折射率的對照資料e）對被分離樣品無損害f）對被分離樣品滲透很少g）在離分離完成后很容易與生物樣品分離h）化學了性放穩定i）對離心過程中所接觸的轉頭材料，離心管，管蓋及密材料，連續流及區帶轉頭的管道等等無腐蝕作用j）純度

13、高k）毒性少l）價格較低m）已知該材料的某些物理、化學、熱力學性能。常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸鉀、漠化鈉、漠化鉀、碘化鈉、碘化鉀、氯化錮、氯化鋤、硫酸鋤、三氯（耳苯酸鉤、三氟醋酸錮、右旋糖昔，白蛋白、Ficoll,percoll,mettizamide,Nycodebnz,Ludox,Dextian等等（III）梯度形狀的選擇：所謂梯度形狀是指梯度介質沒著離盡管長充方向的密度變化特征。用于R-z離心密度梯度常用連續梯度也變是密度隨著離心本徑的增加而光滑地（不是實變化）增大，直線型的，光滑曲線型的（一般用凸指數或凹指數曲線，或凸凹指數曲線聯用的）都屬于連續梯度。不連續（

14、階梯型）梯度采用于等密度離心。*線型：在甩平轉頭中做R-z離心最常用線性梯度。制各線性梯度時要注意：(a) 在甩平或垂直轉頭中制各線性梯度時，梯度液西的密度必須足支持樣品，而底部密度必須少于被分離樣品組份的密度。(b) 一般地說較大的梯度斜率可以得到較高分辨率(c) 蔗糖的常用線性梯度范圍是520%W/V或1040%W/V(d)可以用梯度議制各線性梯度，也可以人工輔設整個價梯型梯度，離心管二靜置一致時間后也可以形成近線性梯度。*等運動梯度(等速梯度)(Isokinetic)等運動梯度是指在某一恒定離心轉速時，樣品顆粒在梯度中以定常速度沉降。在做到等速沉降，必須使梯度和粘性力的增加與沿著離心本徑

15、方向的離心力增加相平衡，在這種梯度液中，顆粒的沉降距離與離心時間，離必力，以及顆粒本身的沉降多數成正比。因此如果已知某單一組份樣品的沉降分數，就可以算出在同一梯度中沉降的其他組份的沉降系數。在甩平轉頭中用等速沉降梯度時，從旋轉中心算起的離心距離與沉降系數的關系應該是線性關系。為了構造等速沉降梯度種慢必須注意到轉頭、離心管，梯度合質的密度，濃度和粘性系數在同一溫度。在甩平轉頭中作蛋白質分離常用520%(W/V)的蔗糖梯度在5攝氏度離心可以達到近似的等速沉降的效果，而1030%(W/V)的甘油梯度在5攝氏度時分離DNA或RNA也可以達到近似等速沉降的目的其他大金數樣品分離的等速沉降梯度是凸指數型曲

16、線。*凸型指數曲線與凹型指數曲線梯度：為了支持樣品使其中組份在離心開始前不致于沉入梯度，我們常常望梯度曲線在近度面處有較陡的斜率，也就是說在近液面處梯度液的密度沿離心管長度方向增加得很快。這就是凸指數曲線梯度，與比相反，如果液面處梯度液足以支持(托住)樣品，故慮到某些樣品在離心管中下部需要較慢的沉降率(在高密度區)才能得到理想的分辨率，那么凹型指數曲線型梯度變能滿足這個要求。*復合型梯度：如果用程序梯度儀來制備梯度，那么上節中的凸凹指數曲線梯度可以復合在同一梯度液中，這樣的復合梯度在它們各自的區域保持了它們各自的優點。當然也制備其他類型的復合梯度。一般說，復合梯度多用于區帶離心。(2) 等密度

17、離心，梯度要素的選擇：(I)梯度材料及梯度溶液選擇：所有的等密度離心都使用水溶性緩沖劑作溶劑，緩沖劑的組成及PH值取決于生物樣品的性質。對細胞，亞細胞結構或其他生物大分子的等密度離心分離各有不同要求。常用于等密度離心梯度材料有：材料名稱DNARNA核蛋白膜亞細胞器細胞病毒蔗糖不適合不適合可用較好較好可用較好IId.J亍Ficoll不適合不適合不適合可用可用最佳較好CSCL最佳Percoll不適合較好最佳不適合不適合不適合較好不適合不適合可用較好較好可用Nycodez可用可用最佳最佳最佳較好較好從上表可以看出，對R-z離心蔗糖是很好的梯度材料，而對于等密度離心，不同的生物樣品對梯度材料的要求有較

18、大差異。（II）梯度型式選擇：離心時，溶液中各種組份都同時處在離心聲中，被分離的組份及梯度材料的分子都在離心力作用下向離心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、區帶轉頭、連續流轉頭）沉降。對于梯度材料，如果它們的沉降速度在離心初始階段遠大于濃度擴散速度，那么就可以形成連續的密度梯度。這就是"自形成梯度”產生的基本原理。我們可以把被分離樣品和梯度材料混合在一起離心，梯度材料去離心過程中形成密度梯度，而樣品中不同組份則沉降（或上?。┲罥J它們自己的等密度區。另一種方法是預先制備好密度梯度，將樣品鋪在離心管（或區帶轉頭）的某一部份（如離心管上部，下部或中部），離心，使樣品中各種組份

19、沉降（或上?。┲罥J它們自己的等密度區前后，從而達到了我們所需要的"平衡”結果。預先形成梯度可以是不連續的（階梯型），也可以是連續梯度。階梯型不連續梯度大多適用于從植物或動物組織的勻漿中分離整細胞或亞細胞器，或用于某些病毒的純化。而連續梯度由于共密度平滑地變化，對于某些生物樣品的多種成份組合的分離可以得到較低市制分辨率而得到了廣泛的應用。選擇自形成梯度還是預形成梯度，主要取決于材料的性質。如果些膠體硅材料可在1000020000xg的離心聲中離心30分鐘就可以自形成梯度（例如美國Dupont公司的的Ludox及瑞典pharmarcia公司的Percoll）。但對某一些材料，自形成梯度

20、的時間很長，對離心力的要求也很高。如CSCL或Meterizamide需要去50000500000xg的離心聲中離心數少時甚至數十小時才能自形成梯度（如用CSCL做質粒DNA分離，梯度液中加E.B.和Tritonx-100,在490000xg需要離心4小時，才能利用CSCL的自形成梯度分離出質粒DNA，染色體DNA,RNA和蛋白質。）預形成梯度的主要優點是離心時間較短，因為我們只要故慮樣品中某個組份到達其等官度區所需要的時間。預形成梯度常被用來分離較大顆粒，如>100S的樣品。預形成梯度的缺點是*被分離樣品的容量較少（與自形成梯度相比）*對某些樣品如細胞或病毒會因單向沉降而產生顆粒聚結從

21、而減少了樣品回收率至影響純度。*預先制備樣度液需較長時間，亦較繁復。與預形成梯度相比較，自形成梯度有較大樣品容積（特別是使用垂直剖面積較大的垂直管或近垂直離心這個優點更突出）；可以簡單地高速初始密度；離心過程中樣品既右上浮又右沉降，也就是混在梯度液中的樣品在離心過程中，在梯度材料自形成梯度的同量從離心力的正反二個方向向自己的等密度區靠擾，最后排列在自己的等密度區上下形成純樣品區帶。從這個意義上說，樣品是真正到達了自己的等密度區而具有很高制純度。自形成梯度的等密度離心又稱均衡等密度離心（Eguilibrim-Isopycnic）（III）自形成梯度綜上所述，某些梯度材料能夠在離心過程中形成密度梯

22、度，Ludox,Percoll中的膠體硅顆?？梢暂^快地向離心管靠低（如甩平轉頭）等或外側（垂直管轉頭）而另一些材料如CSCL,CS2SO4,Metrizamide等則在沉降過程中愛到共反向濃度擴散的影響，達到平衡的時間就比較長。平衡后梯度曲線的形狀不僅依賴于梯度材料本身，也取決于其他一些離心條件。自形成梯度的最基本條件是樣品中需要分離的各種組份在分離后都就包含在梯度范圍中。最佳的自形梯度形狀還應該使被分離后都處在各自的較窄的純樣品區帶內，只有這樣才能得到較高的分辨率。但很多單一組份在尺寸和密度上都有差異。就使得同種樣品區帶離心后顯得比較寬。為了提高分辨率變必須使梯度曲線變得陡一些，但要隨心所欲

23、做到這一點都很困難。幸運的是對于所有梯度材料，計算自形成梯度的公（也就是自形成梯度曲線的形成原理）是一樣的。由于用CSCL分離質粒DNA已有近30年歷史，大多數定量分析工作集中于討論CSCL梯度。用下面的一些公式可以計算自形成梯度曲線的形狀，可用于設計最合適的密度梯度。*梯度曲線的斜率：密度梯度曲線中某一點的最終斜率ds/dr可以用下式計算:是角度（弧度/秒）y:從旋轉中心到計算點的距離（cm）3o：梯度材料的密度梯度比例常數3o的數值請參考余興明"質粒DNA的超速離心分離”或J.B.Martin"Biopolymers"9,1970,P597用這個公式計算梯度曲

24、線的中下部占3/4離心管中梯度高度的ds/dr值比較接近實際情況，對上部1/4長度與實際情況有些差別。從上面公式可以看出，要質曲線變陡a:降低6ob：提高轉速c：加大離心半徑d：增大初始密度以同等轉速離心，甩平轉頭的r較大，在同等初始密度條件下，甩平轉頭的密度梯度曲線比垂直管轉頭，近垂直轉頭或固定角式轉頭都要陡一些。（參見下圖）CSCL初始密度為1.72g/cm3時的自形成梯度曲線九十年代以前生物大分子離心分離實驗多數是利用甩平轉頭，轉速在60000rpm以下，某些實驗一次要離心數十小時，使用的CSCL也較多（分析純，價格高，且不能反覆使用）離心分離成本昂貴（如80年代初期，質粒DNA分離，C

25、SCL初始密度為1.71g/cm3,33000rpm,20攝氏度甩平轉頭離心72小時，一次離心就用去了驅動部1.4億轉的的壽命，而當時的超速離心機驅動部的保用壽命才100億轉，雖然由于CSCL去離心后梯度曲線較陡而獲得了很純的質粒DNA和染色體DNA,但成本實在是太高了）。九十年初開始使用近垂直管（或秒少角度管）轉頭，在CSCL梯度中加入E.B.和Tritonx-100,初始密度1.55g/cm378000rpm,20攝氏度離心4小時（用去驅動部壽命0.187轉）或用垂直錠，同樣的梯度100000rpm,20攝氏度2小時（用去驅動部壽命0.12億轉）都獲得了滿意的結果。（文獻5）*梯度的密度范

26、圍：在不同距離處（r2,r1）密度差可以用下面公式表示：從上式可以看出（S2-S1）值不得和轉速的平方而且和距離的平方差成正比。*轉頭選擇對梯度曲線斜面率與梯度范圍時影響：從前面的曲線圖可以看出對不同轉頭，梯度曲線的差異：甩平轉頭離心時和復原（離心完成）后對于梯度來說，離心管中液面至管底距離保持不變。對固定角式，小角度轉頭及垂直管轉頭，離心頭沉降距離很微短，而在離心后復原時這項距離明顯拉長了，也就是說梯度曲線變得平緩了，這種距離的延伸右利于離心分辨率的提示。因此垂直管轉頭比NVT（近垂直管）轉頭，NVT轉頭比角式轉頭的距離延伸更大，分辨率也就更高。但與此相反，純樣品帶的寬度都是甩平轉頭最窄，垂

27、直管轉頭最寬。*梯度中的最大和最少少密度：計算前，首先要找到等密度點的位置等密度點：離心層密度與率心開始時初始密度相等的點。對于甩平轉頭：設等密度點少rc式中rt：梯度表面與旋轉中心距離：rb：離心管底與旋轉中心距離該公式可用于估算離心結束時（轉頭剛開始減速時）角式轉頭及垂直管轉頭的rc位置。設梯度液初始密度（均勻）為Si,在求得rc后梯度中最大密度與最少密度可用下式計算：如果已經設計好密度變化范圍就可以計算所需要的離心轉速:*計算實例DNA分離，CSCL梯度，初始密度1.70g/cm3,根據離心要求，理想的最大密度為Sb=1.75g/cm3最少密度為St=1.65g/cm3用某甩平轉頭最高轉

28、速55000rpm,rb=12cm,rt=6.7cm則N=45500rpm,校核：由于密度>1.2g/cm3按規定這個轉頭的最高轉速不能超過：=46200rpm46200rpm>45500rpm所以，以上設計成立。*離心時間計算：計算例題中離心所需要的時間：已知r平均=9.35cm，樣品S20,w=15*討論必須注意不能使CSCL在離心管底部最大密度超過1.90g/cm3120oC)否則CSCL將可能析出結晶，而CSCL的結晶密度為4g/cm3，很可能在結晶的局部損壞塑料離心管，從而造成CSCL泄漏而進一步腐蝕轉頭，(特別是鋁合金轉頭)而造成轉頭在離心中炸裂的嚴重事故。為安全起見，生金屬的梯度實驗不要去鋁合金轉頭或甩平轉頭中的鋁合金吊桶中做。(IV) 預形成梯度：*不連續(階梯形)梯度：分層鋪設不連續梯度，樣品鋪在梯度液之上，離心時不同組份越過少于本身浮密度時梯度層次而最后達密度樣品浮密度的梯度界面之前形成純樣品區帶。一般設置三至五個層次。*連續梯度根據被分離樣品的性質設計線性，凸指數，凹指數或凹