1、畢赤酵母表達的培養基配制52.1 LB（LuriaBertani）培養基：Tryptonl%YeastExtract0.5%NaCll%PH7.0制作平板時加入2%瓊脂粉。121c高壓滅菌20min。可于室溫保存。用于培養pPICZ”A原核宿主菌TOP10F時可加入Zeocin25ug/ml。2.2 LLB（LowSaltLB）培養基：Tryptonl%YeastExtract0.5%NaCl0.5%PH7.0制作平板時加入2%瓊脂粉。121c高壓滅菌20min。可于室溫保存數月。用于培養pPICZaA原核宿主菌TOP10F時，加入Zeocin25ug/ml,可以4c條件下保存12周。2.3

2、YPD（又稱YEPD）YeastExtractPeptoneDextroseMedium,（YeastExtractPeptoneDextroseMedium,酵母浸出粉/胰蛋白月東/右旋葡萄糖培養基）Trypton2%dextrose（glucose）2%+agar2%+Zeocin100科g/ml液體YPD培養基可常溫保存；瓊脂YPD平板在4c可保存幾個月。加入Zeocin100ug/ml,成為YPDZ培養基,可以4c條件下保存12周。2.4 YPDS+Zeocin培養基（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）:yeastextract1%peptone2%d

3、extrose（glucose）2%sorbitol（山梨醇）1M+agar2%+Zeocin100科g/ml不管是?體YPDS培養基，還是YPDS+Zeocin培養基，都必須存放4c條件下，有效期12周。2.5 MGYMinimalGlycerolMedium（最小甘油培養基）（34%YNB;1%甘油；4*10-5%生物素）。將800ml滅菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4c保存，保存期為2個月。2.6 MGYHMinimalGlycerolMedium+Histidine（最小甘油培養基+0.004%組氨酸）在1000ml的M

4、GY培養基中加入10ml的100*H母液混勻，4c保存，保存期為2個月。2.7 RDRegenerationDextroseMedium（葡萄糖再生培養基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB;4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1.將186g的山梨醇定容至700ml,高壓滅菌；2,冷卻后于45c水浴;1 100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預熱至45c后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4c保存。RDHRegenerationDextroseMedium+Histidine（葡萄糖再生培養

5、基+0,004%組氨酸）在RD培養基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4c保存。RD及RDH平板的制備1,將186g的山梨醇和15-20g瓊脂粉定容至700ml,高壓滅菌；冷卻后于60c水浴；.參照RD/RDH液體培養基配制的步驟4,將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預熱至45c后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；.迅速制備平板。4c可保存數月。.10RD及RDH的TOP瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被

6、）1,將186g的山梨醇和7.510g瓊脂粉定容至700ml,高壓滅菌；冷卻后于60c水浴;照RD/RDH液體培養基配制的步驟4,將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預熱至45c后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3,將該TOP瓊脂置于45c水浴冷卻、保溫，備用。2.11MD與MDHMinimalDextroseMedium+（Histidine）最小葡萄糖培養基+（0.004%組氨酸）（含有：1.34%YNB;4*10-5%生物素；2%葡萄糖）100ml的10*YNB;2m

7、l的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可；2,如配制MDH,可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；配制平板，可無菌水的滅菌前，加入1520g的瓊脂。4c可保存數月。SOC培養基：Tryptonl%YeastExtract0.5%NaCl0.05%Glucose（1mol/L）2%121c高壓滅菌20min,冷卻后，4c保存MM培養基：M9母液：64g磷酸氫二鈉，15g磷酸二氫鉀，2.5g氯化鈉，5.0g氯化錢加1L水滅菌取M9母液200ml加水700ml,力口2ml1mol/l已滅菌的硫酸鎂，加100微升已滅菌的1mol/l氯化鈣（可加可不加）

8、。注意硫酸鎂和M9母液要分開滅菌不然會有沉淀。在M9培養基基礎上添加0,5%葡萄糖即為MM培養基。BMGY/BMMY培養基：酵母粉：1.0克，蛋白月東：2.0克，YNB:1.34克，0.1mol/LpH6.0（或者pH7.0）磷酸緩沖液，甘油：1.0毫升，加蒸儲水到100mLBMM培養基，全稱：Bufferedminimalmethanol即最小緩沖甲醇培養基，常用于表達分泌型蛋白的培養基。配制：100mMpH6,0磷酸鉀1,34%YNB4X10-5%生物素0.5%甲醇.滅菌700ml水，.冷至室溫，加入下列：100ml1MpH6.0磷酸鉀緩沖液，100ml10YNB,2ml500汨，100m

9、l10>M.放置于4度，可放2個月10>YNB（13.4%酵母氮源堿（YNB）含硫酸鏤不含氨基酸）溶解134gYNB于1000ml水中，過濾除菌，加熱至YNB完全溶解，存于4度。或者用34gYNB（不含硫酸鏤不含氨基酸），100g硫酸鏤進行配制，可放1年。注意畢赤酵母在高濃度YNB下生長更好。YPD:最基本的培養用；BMGY:誘導表達前培養用；BMMY:誘導表達用；MD:電轉化后篩選his+用。YEPD是不能代替BMGY的，因為有葡萄糖，這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導表達。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。

10、搖瓶畢竟不能和發酵罐比，甘油殘余會抑制甲醇利用。BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加100%甲醇至你要的濃度。YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待培養基高壓滅菌后加入；配YPD時可以加入YPD一起滅菌，但時間不能太長，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時間過長，溫度過高，可能導致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產生美拉德反應，這是配制培養基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養基108度35min高壓滅菌

11、。小量發酵其實可以把培養基成分中的YNB和生物素去除，培養基價格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。如果是用自己配置的培養基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥熬浸提液等等，可以不用換液，采取添料來維持酵母對培養基的營養需要。用無機鹽進行大規模發酵，更省錢。大規模發酵時，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用純氧并不昂貴，在武漢買個鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個批次100h左右估計34瓶氧氣。關于Tryptone和Peptone的選擇：1）用培養E.coli的Tryptone替彳弋Peptone對有些酵母菌可以，例如一般的表達酵母.但是對有酵母菌些絕對不行.例如

12、做雙雜交的AH109,Y187之類表達酵母，根本就長不好.2）Tryptone和Peptone雖然都是營養月東，但營養成分不一樣.即使是一般的表達酵母可以在Tryptone生長，生長狀態也沒有在Peptone中好.但tryptone和peptone就是含量上有點不同外，其他沒彳f么區別，用peptone的目的不是為了提供氮源，提供氮源的是培養基里面的YNB。3）如果要求不高，一般使用也還湊合.盡可能的用Peptone,difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它國產的蛋白月東都可以很正常的培養絕大多數酵母菌.4）用含Peptone的培養基顏色很深，純化表達蛋白時顏色要去掉，所以還要進行麻煩的后

13、續處理。而改用Tryptone后，培養基顏色變得很淺，和LB（液體）顏色差不多，后續處理要簡單些。invitrogen說明書說peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶類水解，加入peptone的目的就是競爭性抑制目的蛋白的水解，因為peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。培養畢赤酵母，書上說BIOTIN儲液是水溶液，但事實上BIOTIN很難溶于水，可以稍稍水浴加熱一下。配制500XBIOTINstocksolution（0.02%）有這么3種方案：1）、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶；2）、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH,就很容易溶解了；3）、水

14、浴加熱，溫度不能高于50度。D生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養基中一般可以不單獨添加，因為YNB中、酵母粉、蛋白月東中均含有一定量的生物素，但是做高密度發酵還是必須要添加的。MD、MM屬于基礎培養基，沒有哪種成分會含有微量生長因子（如生物素）。所以肯定要加的。附：無機培養基配方BSM無機培養基：85%H3PO426.7ml/LCaSO4?2H2O0.93g/LK2SO418.2g/LMgSO4?2H2O14.9g/LKOH4.13g/L甘油40g/LPMT14.0ml/L100%氨水調pH5.0（1瓶50ml加800ul氨水）或10g/L硫酸鏤調pH5.0，氨水用于上罐調pH（便宜，方便）。誘導表達前調pH6.0opH5.0是為了防止BSM形成磷酸車沉淀，pH6.0是表達HSA融合蛋白的最適pH。BSM