1、CO2與二組疏水蛋白之間的相互作用的建模和生理特性：原始噴涌機制的新發現付臣譯自ASBCJ-2012-0905-01摘要：盡管普遍認同疏水蛋白和CO2是造成CO2飽和飲料的原始噴涌的原因，但是這個現象的生物分子機制并沒有被很好的理解，在此疏水蛋白HFBII已經被生產、萃取和純化，一個噴涌實驗和DLS分析已經完成，并允許作者設計了一個MD模擬計劃以研究CO2分子與HFBII之間的相互作用，結果預示CO2分子傾向于聚積在疏水蛋白的疏水補丁上能達到蛋白質其它區域的兩倍，這就提出了這樣一個用“納米炸彈”的形成，闡明了原始噴涌機制的一定的化學和生理性質的模型。關鍵詞：CO2,噴涌，疏水蛋白，MD模擬，納

2、米氣泡導言在受污染的象啤7S這樣的含有CO2的飲料中，瓶裝啤酒在開瓶時，不受控制脫氣現象的科學描述，來自受霉菌污染的有機物質參與，以及涉及圍繞在被加壓的CO2周圍的固體膜及大約100納米（大氣壓力下氣態CO2的臨界直徑）的球形氣體結構的發現的假說，都是報道啤酒原始噴涌機制的基本陳述。實際上，所有研究都是說了只言片語，只說原始噴涌的機制，但并沒有解釋噴涌機制的生理細節。先前的研究暗示溶解的氣態CO2與疏水蛋白的疏水補丁有關，這個相互作用易受純的疏水分子，例如不飽和脂肪酸和一些植物提取物如酒花油的存在的影響。然而，納米氣泡形成的詳細機制及關于在一個密閉的受污染的壓力容器中發生了什么的原子假說構想仍

3、然沒有被闡明，這種納米結構被定義為納米炸彈，因為它們將在瓶打開時突然爆發，因此一個深入的物理化學研究被執行以研究在水溶液中氣態的CO2存在下疏水蛋白的行為作用。一組疏水蛋白SC3和同類型的二組疏水蛋白HFBI及HFBII是理解原始噴涌期間發生的納米規模變更的基礎事件，疏水蛋白聚集成納米結構的彈性對闡明親-疏水界面的特殊重新修整是必須的。再者，完全有必要理解在潛在污染劑存在的情況下，控制氣態CO2在水溶液中溶解的物理法則，所以花費科學家25年的時間去完成一個解釋液體中納米球面結構逐步形成和瓦解的具體模型是可以理解的。疏水蛋白是真菌引起的蛋白質（大約100個氨基酸，7-15kDa）,通過它們能在疏

4、-親水界面如空氣和水界面形成兩性分子層的能力來定性的，基于在這個聚集層上的溶解度，疏水蛋白被分成兩組，一組疏水蛋白能夠組裝進入蛋白質膜成為剛性膜，除非使用強酸否則很難溶于水中，相反二組疏水蛋白自己組裝成一個單層彈性膜，它可以被試劑或使用壓力解離。原始噴涌看起來主要與二組疏水蛋白有關，并且報道較低的數量（大約3g/L）就足以引起噴涌。疏水蛋白的疏水補丁被猜想是造成和氣態CO2相互作用，導致具有高彈性的疏水蛋白聚集形成膜而致穩定的氣態CO2納米氣泡的形成的原因。為了理解這樣一個機制，要求有一個計算技術的使用，基于經典的牛頓物理學法則，分子動力學模擬用于此研究以了解CO2分子與疏水蛋白HFBII之間

5、在溶劑（水）中自由基鍵合傾向，總之，通過描述HFBII與分子氣態CO2的密切關系，MD結果支持了此實驗結果及存在納米炸彈的假說。實驗HFBII蛋白的生產里氏木霉MUCL44908在安裝有攪拌器的1升的發酵桶中25c發酵7天，含水的培養基由乳糖（40.0g/L）、蛋白陳（4.0g/L）、酵母浸膏（1.0g/L）、KH2P04（4.0g/L）、（NH4）2SO4（2.8g/L）、MgSO2.7H2O（0.6g/L）、CaCl2.2H2O（0.8g/L）及含有FeO4.7H2O（0.5g/L）,CoCl2.6H2O（3.7g/L）、MnSO4.H2O（1.6g/L）和ZnSO4.7H2O（1.4g/

6、L）的微量溶液（2mL/L）組成，用磷酸調節PH到4.55.0,最后菌絲體通過離心分離（8,000xg離心25min）,然后上清液在2c下貯存直到將來的分析。萃取步驟后，上清液泡沫分儲，泡沫用一個親水的聚酯碉過濾器過濾，使用RP-LC來源15RPC色譜柱（4.6X200mm）的液相色譜進行純化，用線性梯度（從0至60%,50min）的乙晴以1mL/min的流速進行洗脫，并在214nm下進行紫外檢測，乙晴為含有0.1%三氟乙酸（TFA）的MilliQ水（millipore公司生產的超純水）溶液。使用帶有一個UltraflexII儀器的基質輔助激光解吸/電離飛行時間和a-氟基-4-羥基肉桂酸進行鑒

7、定，一個顯微分光光度計（280nm波長，&=10）用于純化的疏水蛋白HFBII的最終定量。噴涌實驗和DLS分析噴涌實驗和動態光散射（DLS）分析按以前描述的方式進行，研究了在封閉的系統中氣態CO2存在的情況下二組疏水蛋白的行為，為此一定數量有純HFBII被加入冷卻到2c的蘇達水（7g/LCO2）中，以使HFBII的最終濃度等于0、4.5、9和18g/L,然后進行噴涌實驗，并收集溢出泡沫進一步用DLS進行分析。MD模擬參數超高分辨率的晶體結構2B97被用于模擬二組疏水蛋白的隨時間變化的行為，這個晶體結構是一個含有兩個鏈，A和B鏈的二聚體構造，在此只獲得A鏈，鈕離子和水分子去除的也很好，疏

8、水蛋白是一個中性結構，因此沒有抗平衡離子被加入系統，氨基酸適當的質子化狀態用MOE分子操作環境軟件中的質子化3D工具來核實。蛋白質被放在一個十二面體的盒子中，蛋白質與盒邊的距離設定為0.85nm,以確保在MD擬態期間蛋白質不與它們的影像相互作用，考慮到這些設定，盒子的總體積大約為90nm3,9個CO2分子被隨便加入盒中，殘余部分用2525TIP3P水分子填充，整個系統（蛋白質、水和CO2）大約包含9000個原子。MD模擬所有模擬都用與OPLS-AA力場連接在一起的GROMACS包完成，CO2分子的部分電荷在先前的研究中得到的，通過執行2000步的最速下降及接下來的2000共腕梯度能最小值，系統

9、松弛下來。兩次平衡被完成，首先是100Ps的等容（NVT系綜），然后是100Ps的恒壓（NPT系綜），在平衡步驟期間，所有重蛋白原子都被位限固定，接下來位限固定被去除，系統在NPT系綜下被模擬100ns,每4Ps貯存一個系統快照，通過使用0.1ps耦合常數的V-rescale恒溫調節器及分別耦合蛋白質和溶劑，模擬溫度保持恒定為外部水浴溫度298K。通過分別耦合蛋白質和溶劑及使用1ps耦合常數的Parrinello-Rahman恒壓調節器，使模擬壓力保持外部水浴壓力在4atm。網絡粒子埃瓦爾德法被用于長程靜電學計算，一個1.4nm的近路用于范德華力。LINCS運算法則用于通過限制系統內所有結合力

10、以確保有一個2fs的積分步長。測量我們計算了疏水補丁附近10?球體內每？2可及表面積CO2分子的數量，同剩余蛋白質表面積相比較，下面的18個殘余物被定義為疏水補丁：Gly6、Leu7、Leu12、Val18直到Val24、Val54直到Ala58、Ala61直到Cys64。結果和討論fHFBII的特性純化期間生成的RP-LC色譜圖的例子顯示在圖1中，使用MALDI-TOF分析了幾個微分后，獲得了分子量為7.042kDa的物質，這與缺少末位氨基酸的HFBII分子完全相符，此蛋白質被收集在40-50%的ACN中，末位氨基酸的去除能被解釋為生物降解，因為此效果也已經在毒枝毒素中觀察到。對于所有包含H

11、FBII疏水蛋白的瓶子，噴涌實驗和DLS分析（圖2）都是陽性的，像Deckers等人描述的一樣，當至少100nm直徑（即大氣壓下氣態CO2分子的臨界直徑）的微粒被檢測時，DLS分析是陽性的，此直徑考慮到了用在MD實驗中的CO2分子數量的測定。分子動力學模擬盡管噴涌在不同的碳酸飲料中也已經被描述過，但它對于啤酒來說是有最重大意義的，疏水蛋白和CO2是導致原始噴涌的兩個主要因素，當HFBII被加到蘇達水時，正如在啤酒中一樣觀察到了噴涌，噴涌機制中重點強調了疏水蛋白和CO2兩者的作用。盡管現在廣泛認為疏水蛋白是導致噴涌的主要因子，但我們在此建議CO2扮演了更主要的作用，如果碳酸飲料被裝于PET瓶中，

12、隨時間的推移觀察到噴涌完全消失，此效果能解釋為PET瓶易滲出CO2,這導致CO2減少而最終阻止了噴涌潛勢。當CO2溶解在水中，便產生下面的平衡：I壇1%C03te）.、COJd）+HjO,>H2COi.>HCO/*H*CO+2H*Kh是亨利常數，Ks是溶解常數，Ka1和Ka2代表碳酸的兩個離解常數。二氧化碳與水分子起化學反應形成碳酸，碳酸是不穩定的雙質子酸，反應性明顯促進了二氧化碳的溶解，溶解常數在25c下等于1.7X10-3,但是H2CO3濃度取決于PH,在PH7.0情況下，80%的碳酸解離為HCO3，在25c下Ka1=6.4。為了獲得大約7g/L的CO2濃度，如亨利法則陳述的要

13、施加壓力提高CO2的溶解度，CO2在水中溶解越多，碳酸形成越多，解離的HCO3也越多，同時提高了H+濃度導致了PH降低。當PH降低到比Kai值低時，平衡將向左移動，碳酸最終變成CO2,蘇達水有終PH為4.0以致于主要的物質都是溶解的CO2,啤酒的情形也沒有太大區別，啤酒認為是一種磷酸緩沖液，有PH4.0-4.3,平衡也直接向溶解的CO2進行。先前為了研究疏水蛋白的行為例如可折疊的及與疏水-親水表面相互作用的行為，進行了多個MD模擬實驗。在此我們進行了MD模擬以研究CO2聚集在溶劑中二組疏水蛋白的疏水補丁上，此補丁包含專一的疏水脂肪族側鏈，在中央的B-桶結構中形成兩個環形區域。作為一個核實CO2

14、參數的初始實驗，170個CO2分子和2641個水分子被隨機加到約90nm3盒子中，系統被模擬100ns,象預期的一樣，疏水的CO2分子快速地擴散并在系統中形成聚集體，這個在10ns聚集的一個例子顯示在圖3中。接下來，帶有HFBII疏水蛋白、CO2和水分子的系統被模擬100ns,此模擬只有水分子而沒有其它成分目的是研究最簡單的模式，圖4顯示在疏水補丁的鄰近區域內（10?）CO2分子的數量，在整個軌線期每？2的ASA的CO2數量都被計算，并與蛋白質的其它區域進行對比，能看出疏水補丁的鄰近區域，每？2的ASA的CO2分子數量多于蛋白表面的其它區域兩倍，這個效果在20ns模擬時間后最強，這被看作需要一

15、個平衡時間使CO2分子聚集在蛋白質表面上。圖5說明CO2聚集體存在，鍵合在蛋白質的疏水補丁上，疏水補丁本身就有使疏水的CO2分子緊緊地聚集到蛋白質表面的趨勢，能猜想到更多的疏水蛋白存在下這個效果將會被加強，并彼此聚合由此增加疏水補丁區域，并減少和蛋白質其它區域的接觸，從模擬實驗也看出CO2鍵合并沒有特定發生在疏水補丁上，而且在蛋白質的其它疏水區域也發生了，如圖5看到的一樣，可能在多量的疏水蛋白低聚反應下，這些區域能被掩埋，從而減少了CO2在這些位置的鍵合。值得注意的是，在模擬期間某些CO2分子在疏水蛋白的內腔被捕獲，并封存在蛋白質內。納米氣泡形成和噴涌機制在CO2和疏水蛋白之間的強相互作用導致

16、了噴涌現象需要的穩定的納米氣泡的形成，在一個封閉容器中，這些穩定的納米氣泡的形成能在6個連續的階段被描述（圖6）0在第一階段，被CO2污染的疏水蛋白和沒有被污染的疏水蛋白都存在于液體中；第二階段，由于疏水蛋白是兩性分子，它們遷移到疏水-親水液-氣界面，在界面上由于與大氣中CO2接觸都被污染；第三階段，疏水蛋白在界面上自我組合，當臨界濃度到達時形成水晶單層。提供能量（例如搖動）給這個封閉系統將會打破通過亨利法規建立的這個平衡，并且疏水蛋白薄層進入液體，這將導致瓶子的親水玻璃壁與疏水蛋白層的親水部分之間相互吸引，并且通過氣態CO2的聚集，疏水部分將扮演一個納米氣泡形成的停泊地或加油站。事實上，為了

17、回到平衡，在氣相和液相間CO2分子的交換發生了，由于它們能減少表面張力從72mJ/m2到30mJ/m2的能力，也因為它們的結構彈性，二組疏水蛋白能聚集氣態CO2分子，并且最終通過由Young-Laplace法則引起的側向力形成穩定的納米氣泡。納米氣泡形成后，噴涌現象能被在5個階段考慮，在一個封閉的瓶子中、瓦解和爆炸、晶核形成、起泡和脫氣。在密閉瓶子中，被疏水蛋白的結晶層穩定的氣態CO2納米氣泡與啤酒隔絕，穩定的納米氣泡的內壓力等于瓶內壓（4bar左右），在打開瓶子時，這些被增壓的納米氣泡將扮演納米炸彈的角色。當瓶子打開時，壓力下降導致彈性的疏水蛋白結構瓦解及納米氣泡爆炸，爆炸提供了晶核形成的能

18、量，并且溶解的CO2釋放，由爆炸引起的氣泡代表了局部有較高的氣態CO2濃度，由于啤酒中過飽和的CO2的擴散使氣泡越來越多，當它們上升到表面，增長的氣泡吸引蛋白質并產生溢泡現象，如果溢泡及殘余飲料任其在大氣壓下脫氣，通過直徑等于大氣壓下臨界直徑，被疏水蛋白薄層穩定的納米氣泡將被改造，這通過DLS分析能發現。結論為了揭示原始噴涌機制的生理細節，首次進行了MD模擬實驗，通過此技術我們證實在CO2的二組疏水蛋白之間的疏水相互作用導致了CO2納米炸彈的形成，此納米炸彈有在壓力釋放時劇烈起泡的能力，這些發現讓我們認為這些納米炸彈以這樣幾個步驟形成：首先，疏水蛋白被CO2污染；第二，疏水蛋白遷移到界面；然后

19、當達到臨界濃度時結晶化，接下來通過提供能量給系統，由于平衡被打破，CO2分子交換，最后納米氣泡形成。補充數據為了精確模擬疏水蛋白HFBII和CO2分子之間的相互作用，放在盒子中用于MD模擬的CO2分子的數量必須被計算，這些計算以DLS實驗和在大氣壓下CO2納米氣泡顆粒大小的觀察為基礎，這里給出了詳細的計算：計算S1:詳細計算放在盒子里用于MD模擬的CO2分子的數量由于通過DLS檢測到CO2分子在1大氣壓下（也就是開瓶狀態下）的臨界直徑是100nm,一個氣泡的體積等于：Vlaim=xr3=524x10，nmJ通過氣體一般法則的運用，一個氣泡的體積及CO2在4atm下的臨界直徑能按以下方式測定出來

20、：Be X 卅Platm X V 1atm“ Laim 入 * 1 latm常數u4atm A 14atmPXV4atm= 31.5nm=>d4attn=63nmCO2分子的體積（VCO2）估算為1.35nm3,結合氣泡的體積（V4atm）和CO2分子的體積，在一個氣泡中CO2分子的數量按以下方式估算：y一個氣泡中CO2分子的數量=芽上=97,000個分子。這個數量必須轉換為用于模擬中的盒子的尺寸，知道氣泡的表面積（S4atm）,知道HFBII疏水補丁的溶劑可近區域是7.4nm2,假定只有2/3的氣泡表面積被覆蓋，覆蓋氣泡表面的疏水單體數量按以下方式測定：S4Mm=4立x4凱m=L2x10nm2S,覆蓋一個氣泡的HFBII單體的數量=|,081那么在4atm下，CO2與HFBII的比率等于一個氣泡中CO2分子的數量比率=90覆蓋一個氣泡的HFBII數量意