1、.堿法質粒提取原理剖析-及SDS、酚、氯仿、NaOH的性質與在核酸提取中的應用1、提取液溶液I,50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸鉀/ 2 M 醋酸。2、提取液在作用剖析（1）讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒

2、的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是

3、，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。（2）輪到溶液II了這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4 N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質粒

4、。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，后面我再詳細說明。（3）每個人都知道，溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的

5、本質最容易產生的誤解是，當 SDS碰到酸性后發生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2 M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉淀，那會不會是遇鹽發生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的 NaCl，你會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是 KCl，你會發現沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecylsulfate

6、）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀了。讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和N

7、aOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。（4）蛋

8、白質的繼續清除不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質沉淀了，其實還有很多蛋白質不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質量穩定的質粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發生降解。用 25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。a、酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。b、還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），應此如果單獨用