1、1蛋白原核表達 衛文強 2015.122 目的基因-T 表達載體 酶切， 膠回收，連接 轉化到克隆用細胞（Top10) 提質粒，酶切驗證 轉化到表達用細胞（BL21（DE3)） 誘導表達 SDS-PAGE3DNA中的雜質如中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙蛋白質、酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。等都會影響酶的活性。 1）. DNA的純度的純度 影響限制性內切酶活性的因素影響限制性內切酶活性的因素2）. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾CCA/TGG的的C）。）。43）. 溫度 不同的限制性內

2、切酶的最適反應溫度不不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。同。大多數是大多數是37 oC，少數要求，少數要求40-65 oC。是影響限制酶活性的重要因素。是影響限制酶活性的重要因素。4）. 緩沖液(Buffer) 商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。MgCl2、NaCl/KCl： 提供提供Mg2+ +和離子強度；和離子強度； Tris-HCl： 維持維持pH； 二硫蘇糖醇（二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩定性；）：保持酶穩定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩定；等：有助于酶的穩定；巰基乙醇巰基乙醇：保持酶的穩定性，防止酶失活。5 用時在冰上操

3、作； 取酶用干燥、滅菌、新的槍頭 酶用量不能超過酶切總體積的10%； 多種酶進行酶切時，先低鹽后高鹽先低鹽后高鹽緩沖液；關心小關心小貼士告貼士告訴你訴你 使用時注意事項：使用時注意事項：6連接、轉化與重組子鑒定連接、轉化與重組子鑒定1、連接、連接7（1）必須是兩條）必須是兩條雙鏈雙鏈DNA。（2）DNA 3 端有游離的端有游離的-OH， 5端有一個磷酸基團（端有一個磷酸基團（P）。）。（3）需要）需要能量能量動物或噬菌體中：動物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中：大腸桿菌中： NAD+ +（2）. 連接條件連接條件8 ATP：反復凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝； 單價離子

4、：150-200mM NaCl，提高連接效果； PEG：5%以下可以提高連接效率連接效果最好在37 ，但形成的互補不穩定;最佳連接溫度：最佳連接溫度：12-16 ，較好的連接效果，互補又較穩定;2）連接）連接溫度：溫度：3）反應液中的成分：反應液中的成分：9目的或作用：目的或作用：4）插入片段與載體的濃度比例）插入片段與載體的濃度比例 載體載體DNA與外源與外源DNA的分子摩爾比通的分子摩爾比通常為常為13左右，甚至左右，甚至110 或更高或更高。增加插入片段與載體的接觸機會，減增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現象。少載體自我連接的現象。10 化學法（化學法（CaClCaCl2

5、 2法法) )：轉化原理：是Ca2+2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構液晶結構，后者經熱脈沖經熱脈沖發生收縮作用，使細胞膜出現空隙細胞膜出現空隙，質粒或DNA重組分子便可進入細胞內（感受態細胞）。2、轉化、轉化11影響轉化率的主要影響因素影響轉化率的主要影響因素: : 載體本身的性質及其空間構象：超螺載體本身的性質及其空間構象：超螺旋構象轉化率最高；旋構象轉化率最高； 插入片段的大小：插入片段越大，轉插入片段的大小：插入片段越大，轉化效率越低；化效率越低； 受體細胞的類型及預處理；受體細胞的類型及預處理； 轉化方法：電擊法高于化學法。轉化方法：電擊法高于化學法。12ROPROISal IB

6、amH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori 限制性酶切圖譜法限制性酶切圖譜法3、轉化子的篩選和鑒定、轉化子的篩選和鑒定13質粒質粒DNADNA的提取的提取基因組DNA質粒DNA 質粒具有自主復制質粒具有自主復制和轉錄能力，能在子和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。帶的遺傳信息。 質粒質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳是一種染色體外的穩定遺傳因子，大小從因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環不等，為雙鏈、閉環

7、的的DNA分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。胞中。14質粒質粒DNA提取方法：提取方法：堿裂解法堿裂解法、煮沸法、煮沸法、 SDS法等法等 堿裂解法堿裂解法原理：原理： 在堿性堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結構破壞變性，環狀超螺旋質粒不充分不充分變性變性。在中性條件下變性質粒恢復原來構型，而線性大分子細菌DNA不能復性呈不溶物而經離心除去。15 抽提出質粒的構型：抽提出質粒的構型：1 1）超螺旋質粒質粒DNADNA: :在提取質粒過程中，在提取質粒過程中，超螺旋超螺旋DNADNA占大部分。占大部分。2 2）開環質粒質粒DNADNA：如果質粒：如果質粒DNA

8、DNA兩條鏈中兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂，分子就能有一條鏈發生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成松馳型的環狀旋轉而消除鏈的張力，形成松馳型的環狀分子，稱開環分子，稱開環DNADNA。3 3）線狀質粒質粒DNADNA：如果質粒：如果質粒DNADNA的兩條鏈在的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀同一處斷裂，則形成線狀DNADNA。16抽提出的質粒三種構型電泳結果： 1）開 環 2）線 狀 3）超螺旋+-電泳方向電泳方向17凝膠電泳技術凝膠電泳技術電泳目的：對核酸分子進行分離和檢測電泳目的：對核酸分子進行分離和檢測18 凝膠分辨DNA的能力： 瓊脂糖 聚丙烯酰胺凝膠 濃度 分辨范圍

9、(kb) 濃度 分辨范圍(bp) 0.3% 5-60 3.5 1000-2000 0.6% 1-20 5 90-500 0.7% 0.8-10 8.0 60-400 0.9% 0.5-7 12 40-200 1.2% 0.4-6 15 25-160 1.5% 0.2-3 20 6-100凝膠濃度凝膠濃度: 濃度濃度大大，篩孔小，適合，篩孔小，適合小小分子電泳；分子電泳； 濃度濃度小小，篩孔大，適合，篩孔大，適合大大分子電泳分子電泳凝膠濃度的選擇：取決于待檢測的凝膠濃度的選擇：取決于待檢測的DNA的大小的大小原來如此！19電泳緩沖液電泳緩沖液 pH值：偏堿性，帶負電荷值：偏堿性，帶負電荷 離子濃

10、度：離子濃度高離子濃度：離子濃度高 電流大電流大 發熱快發熱快膠溶解膠溶解 種類：種類：TAE （Tris+EDTA+醋酸）醋酸）:電流大，易產生離子富集電流大，易產生離子富集TBE （Tris+ EDTA+硼酸）硼酸）:緩沖能力最強緩沖能力最強TPE （Tris+ EDTA+磷酸）磷酸）:緩沖能力低緩沖能力低TNE （Tris+ EDTA+醋酸鈉）醋酸鈉）20pET表達載體表達載體21222324pET表達載體的啟動子是表達載體的啟動子是T7噬菌體基因噬菌體基因10啟動子（啟動子（T7啟動啟動子），需要子），需要T7RNA聚合酶才能轉錄。聚合酶才能轉錄。 T7RNA聚合酶轉錄機制十分有效并具

11、有選擇性：充分誘導聚合酶轉錄機制十分有效并具有選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；在非誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；在非誘導條件下，幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉錄。條件下，幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉錄。 T7RNA聚合酶基因插入由大腸桿菌聚合酶基因插入由大腸桿菌lacUV5啟動子控制、啟動子控制、DE3溶原狀態下的大腸桿菌染色體上。溶原狀態下的大腸桿菌染色體上。25 T7 表達系統 轉錄調控的機理 化學誘導型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 啟 動子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被

12、插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達載體的宿主菌，調控方式為 化學誘導型，類似于 Lac 表達 系統。 T7 RNA 聚合酶基因 lac 啟動子E.Coli （DE3）T7 啟動子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG誘導2627基本原理 SDS-PAGESDS-PAGE技術是根據技術是根據SDSSDS能使蛋白質變性解能使蛋白質變性解聚成肽鏈并與肽鏈側鏈以一定比例結合成聚成肽鏈并與肽鏈側鏈以一定比例結合成SDSSDS肽鏈復合體，從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷肽鏈復合體，從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷（SDSSDS帶負電），并消除了蛋白質分子間的形狀帶負電），并消除了蛋白質分子間

13、的形狀差異，再結合差異，再結合PAGEPAGE技術（根據分子的形狀、電技術（根據分子的形狀、電荷、分子量綜合差異來分離不同分子的技術）荷、分子量綜合差異來分離不同分子的技術）來分離不同分子量蛋白質或測定定蛋白質分子來分離不同分子量蛋白質或測定定蛋白質分子量的實驗技術。量的實驗技術。28基本步驟 制備分離膠 制備濃縮膠 上樣并電泳 凝膠板剝離與染色脫色 結果分析29出現明顯界面時，出現明顯界面時，分離膠凝聚完成分離膠凝聚完成（ minh）倒出水，并用濾紙倒出水，并用濾紙吸干吸干v制備分離膠制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。30加入濃縮膠溶加入濃縮膠溶液液 pH 6.8v制備濃縮膠制備濃縮膠樣梳需一次平穩插入樣梳需一次平穩插入,梳梳口處不得有氣泡口處不得有氣泡,梳底需梳底需水平。水平。插入樣品梳插入樣品梳31v上樣及電泳上樣及電泳32凝膠板剝離與染色 電泳結束后，撬開玻璃板，將凝