1、第七講噬菌體載體與柯斯載體吳乃虎中國科學院遺傳與發育生物學研究所2005年8月一、噬菌體的一般問題1 .何謂噬菌體2 .噬菌體效價測定與雙層平板法3 .噬菌體的生命周期4 .噬菌體的溶源生命周期5 .超感染免疫6 .溶源性的誘發7 .Campbell模型二、，一噬菌體載體1 .九噬菌體的生物學概述2 .九噬菌體載體的構建(1) K噬菌體載體構建的基本原理(2)插入型載體(3)替換型載體3 .九噬菌體載體的改良(1)Spi-正選擇的人噬菌體載體(2)具有內刪除特性的九噬菌體載體4 .九重組體DNA分子的體外包裝(1)九重組體DNA的轉染作用(2)九噬菌體的體外包裝5 .九噬菌體DNA的包裝限制問

2、題(1)包裝限制的概念(2)包裝限制與兒噬菌體的克隆能力(3)包裝限制的生物學意義6 .九重組體分子的選擇方法(1)cI基因功能選擇法(2)lacZ基因功能選擇法(3)Spi-選擇法三、柯斯質粒載體1 .柯斯質粒的定義及其構建(1)兒噬菌體的克隆能力(2)柯斯質粒載體定義(3)柯斯質粒pHC79的構建(4)柯斯質粒克隆能力及其組成2 .柯斯質粒載體的特點3 .柯斯質粒載體的改良4 .柯斯克隆(1)定義(2)理論依據(3)柯斯質粒包裝條件(4)柯斯克隆程序(5)柯斯克隆的優點5 .柯斯克隆的改良(1)柯斯克隆的局限性及其克服辦法(2) Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3) Bate

3、s-Swift克隆方案噬菌體載體與柯斯質粒載體一、噬菌體的一般問題1 .何謂噬菌體？定義噬菌體英文名為Bacteriophage簡稱phage,來源于希臘文“phage，系指吞食之意，乃是一類細菌病毒的總稱需要指出的是，“phage”這個英文單詞既是單數又是復數形式。作單數使用時是指一個噬菌體，如試管中含1個T4phage;而用作復數使用時，則是指同一種噬菌體的眾多顆粒，如試管中含有上百個的T4phage。aphages是噬菌體的復數詞，是指多種不同的噬菌體。例如：試管中含有T4和T7等多種phages(2)噬菌體的核酸類型及結構*1.與質粒相比，噬菌體的結構顯然要復雜得多，但與細菌或真核細胞

4、相比，則顯得十分簡單。它的DNA分子中除了復制起點之外，還編碼著外殼蛋白質的基因。噬菌體的核酸最常見的是雙鏈線性DNA、雙鏈環形DNA、單鏈環形DNA、單鏈線性DNA及單鏈RNA等多種形式。*2.不同的噬菌體顆粒結構相差甚大，可歸結為如下三種基本類型：a.無尾部結構的二十面體型；b.具尾部結構的二十面體型；c.線狀體型。圖7-1T2噬菌體顆粒的結構示意圖迄今已知的大多數噬菌體都是屬于第二種結構類型(圖7-1),在其二十面體型的頭部下端，連接著一條尾部結構，恰似一種小型的皮下注射器。2 .噬菌體效價測定與雙層平板法(1)效價定義效價(titer)又叫滴度，系指單位體積的噬菌體制劑中所含有的具感染

5、能力的噬菌體顆粒的數目。它以每毫升噬菌體制劑中的噬菌斑形成單位pfu/ml表示。(2)效介的測定(titering)10倍稀釋法與雙層平板法(3)噬菌斑形態混濁型與清晰型3 .噬菌體的生命周期(1)噬菌體的生命周期包括* 1.溶菌生命周期一一產生子代噬菌體* 2.溶源生命周期一一不產生子代噬菌體烈性噬菌體和溫和噬菌體:* 1.烈性噬菌體只具有溶菌周期的噬菌體(phage)* 2.溫和噬菌體一一具有溶源周期的噬菌體(3)烈性噬菌溶菌生長周期：吸附一注入一轉變一合成一組裝一釋放4 .噬菌體的溶源生命周期(1)若干基本概念* 1.溫和噬菌體(temperatephage)既能進入溶菌生命周期又能進入

6、溶源生命周期的噬菌體，叫做溫和噬菌體。* 2.溶源性細菌(lysogen)在染色體基因組上具有一套完整的噬菌體基因組的細菌叫溶源性細菌。如果某些噬菌體基因缺失了，那么這樣的噬菌體就不能夠完成其溶菌周期，故含有這樣噬菌體的細菌，叫做缺陷性的溶源性細菌。* 3.溶源化(lysogenization)用溫和的噬菌體感染細菌培養物，使寄主細菌轉變為溶源性細菌的過程，叫做溶源化。溶源化的分子本質是噬菌體的DNA整合到寄主細菌染色體基因組DNA之中，成為它的組成部分。* 4.整合(integration)噬菌體DNA組入寄主細胞染色體DNA的過程，稱為噬菌體DNA的整合或插入(insertion)。整合的

7、準確定義是：小分子量的DNA分子插入到大分子量的DNA分子中的重組過程。參入(incorporation)* 5.原噬菌體(prophage)在溶源性細菌中存在的處于抑制狀態的整合的或非整合的噬菌體DNA叫做原噬菌體5 .超感染免疫(再感染免疫)(1)超感染免疫定義溶源性細菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。溶源性細菌具有的這種抗御同種噬菌體再感染的特性叫做超感染免疫。(2)超感染免疫理論解釋* 1.阻遏基因cI:編碼阻遏蛋白質分別同啟動基因Pl和Pr相鄰的操縱單元(operator)oL及oR結合/同啟動基因pL相鄰同啟動基因pR相鄰* 2.在溶源性細菌中，cI的產物阻遏蛋白

8、是超量的，致使oL和oR處于被結合的狀態，于是RNA聚合酶無法啟動pL和pR進行轉錄，因此處于溶源狀態。* 3.溶源性細菌(對九phage而言的)發生九phage超感染時，當兒phageDNA進入細菌之后，超量的cI阻遏物立即同其空閉的oL和oR結合，從而阻止其進入溶菌狀態。這種被阻遏物分子結合著的操縱單元，阻止phage發育成溶菌狀態，我們稱這種抑制作用為對同源免疫超感染的抗性。* 4.超感染的九phageDNA將會發生什么變化？超盤旋兒phageDNA復制困難，而細菌細胞卻能正常復制，結果九DNA被“稀釋”。6 .溶源性噬菌體的誘發定義溶源性細菌經過許多世代之后，便能夠開始進入溶菌周期，這

9、個過程叫做溶源性細菌的誘發。(2)原理溶源性細菌的誘發，同樣也是依賴于阻遏基因和操縱單元的相互作用。溶源性細菌中的阻遏物失活一九phage操縱單元oL和oR處于自由狀態一轉錄作用正常發生一結果phage在刪除酶的作用下被誘發游離的九phageDNA再環化。7 .Cacmpbell模型(1)概念*1.九的附著位點att九DNA是整合在大腸桿菌染色體上位于gal操縱子和bio操縱子之間的一個特定位點，這個位點叫做att。*2.int基因九phage編碼的一種整合酶，能夠認別phageDNA和細菌DNA的附著位點。并催化這兩種DNA之間發生鏈的交換。(2)Campbell模型這是一種解釋人噬菌體DN

10、A對E.coli染色體DNA整合作用的模型：九DNA環化成環形分子在細菌DNA附著位點BOB，及噬菌體DNA附著位點POP,發生物理性破裂在這兩個附著位點之間進行準確的噬菌體DNA和寄主DNA的再接合完成整合作用圖7-2Campbell模型二、K噬菌體載體1. %噬菌體的生物學概述(1)基因組結構* 1.粘性末端兒噬菌體的基因組是由雙鏈DNA組成，其線性分子的兩端各有一條由12個核甘酸組成的彼此互補的5'單鏈突出序列，即通常所說的粘性末端。* 2.cos位點注入感染寄主細胞內的,QNA線性分子，會迅速環化形成雙鏈DNA分子。這種由粘性結合形成的特定的雙鏈區段稱為cos位點cos=coh

11、esive-endsite即粘性末端位點* 3.分子長度入噬菌體DNA分子長度為48502bp。* 4.結構為敘述的方便，兒噬菌體基因組被人為地區分為三個區域：a.左側區一一自基因A到基因J,包括參與噬菌體頭部蛋白和尾部蛋白合成所需的全部基因；b.中間區一一介于基因J與基因N之間，又稱為非必要區,該區的編碼基因與噬菌斑形成無關，但包括重組相關基因(redA和redB);整合基因(int),及刪除基因(xis);c.右側區一一位于N基因的右側，包括全部的調控基因，如復制基因(O)和溶菌基因(S及R)。(2)兒噬菌體DNA的復制* 1.在感染的早期：環形的九DNA分子按日形式從雙向進行復制,其復制

12、起點位于cll基因和O基因之間，并且需要O和P蛋白質的參與；*2.到了感染的晚期：控制滾環復制機理的開關被啟動，合成出由一系列線性排列的人DNA組成的多連體分子。但這種多連體分子須經過核酸酶從cos位點處切割之后，形成單體的?QNA之后，才能被包裝起來；*3.九DNA復制所必須的條件a. cos末端(cosends)12bp的粘性末端在體內可以彼此配對而使線性的九DNA重新環化起來。這種12bp的延伸末端是由于cos位點切割形成的，它是在包裝期間發生的。b. O和P蛋白質O蛋白質同DNA結合，而P蛋白則是同寄主編碼的dnaB蛋白質相互作用。c. GAM蛋白質抑制大腸桿菌核酸外切酶V(recBC

13、核酸酶),從而保護滾環復制產生的多連體DNA分子免受核酸外切酶V的破?N抗終止因子(Nantiterminationfactor)引起DNA聚合酶通讀早期的終止區(terminator),表達Q蛋白質以及復制蛋白質。?Q抗終止因子(Qantiterminationfactor)引發RNA聚合酶通讀tR65,表達頭部以尾部組裝蛋白質以及寄主細胞溶菌蛋白質。?復制蛋白質(replicationproteins)噬菌體。和P蛋白質同寄主蛋白質一道工作，使DNA進行復制。?包裝及溶菌蛋白質(Packagingandlysisproteins)為噬菌體生長所必不可少的其它蛋白質。2.九噬菌體載體的構建1

14、 .九噬菌體載體構建的基本原理一一多余位點的刪除野生型的九phage,對大多數限制酶都具有過多的識別位點，例如EcoRI有5個位點，Hindin有7個位點。按照上述原理構成的九phage載體有兩種類型:* 1.插入型載體(insertionvectors)只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。這樣的派生載體叫插入型載體。* 2.替換型載體(replaumentvectors)在兩個限制位點之間的人DNA片段可以被插入的外源DNA片段所取代，這樣的人派生載體叫替換型載體。(2)插入型載體* 1.插入失活效應一一因外源DNA片段的插入而導致噬菌體某種功能的失效，此即所謂的插入失活效應。* 2.免

15、疫功能失活的插入型載體(inactivationofimmunityfunction)在其基因組中有一段免疫區，其中帶有一兩種核酸內切限制酶的單切點，外源DNA片段在此克隆會導致載體失去合成活性阻遏物的功能，而不能進入溶源周免疫功能失活的插入型載體的辨別標記：帶有外源DNA插入片段的載體感染之后，只能形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA插入片段的載體感染之后則形成混濁的噬菌斑。根據噬菌斑形態學特征，選擇體外重組噬菌體和親本噬菌體。*3.P-半乳糖甘酶失活的插入型載體（inactivationofE.coli-galactosidase）在其基因組中含有一段E.coli的lac5區段，其中編碼著P-

16、半乳糖普酶基因lacZ（lacZ基因）感染lac-大腸桿菌菌株（指示菌）IPTG和Xgal的作用形成藍色的噬菌斑選擇標記：具外源DNA片段的九phage形成白色噬菌斑不具外源DNA片段的形成藍色噬菌斑(3)替換型載體入噬菌體載體克隆外源DNA的能力有一定的限制，因此改良九phage載體的一個重要目標是提高載體容納外源DNA片段的能力，以期發展出可以接受任何一種的限制片段的載體系列。從目前情況看替換型載體有可能滿足這樣的要求。*1.根噬菌斑形態選擇的替換型載體例如M.Thomas等人(1974)發展的替換型載體九gt九c,即是屬于根據噬菌斑形態選擇的替換型載體的一例。該載體的可替換片段C含有at

17、t、int、xis3個基因選擇表型：沒有外源DNA取代時，可處于溶源狀態，形成混濁噬菌斑一一非重組體有外源DNA取代時，att、int、xis3個基因被取代，而不能處于溶源狀態。因此形成清晰的噬菌斑一一重組體*2.根據噬菌斑顯色反應選擇的替換型載體N.E.Murrag等人(1977)發展的替換型載體兒NM781,即屬于根據噬菌斑顯色選擇的替換型載體的一例。該載體的可替換片段EcoRI片段含有supE基因由于這種噬菌體KNM781的感染，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變更被抑制了。因此可以在乳糖麥康基氏(MacConkey)瓊脂培養基上產生出紅色的噬菌斑，或是在Xgal瓊脂培養基上產生出藍色的噬菌

18、斑。選擇沒有外源DNA取代時，在乳糖麥康基氏瓊脂培養基上產生紅色噬菌斑，或是在Xgal培養基上產生藍色噬菌斑一一非重組體當EcoRI片段(含supE基因)被外源DNA片段取代時，形成無色噬菌斑一一重組體3.九噬菌體載體的改良【噬菌體載體改良的目的有四:a.增加克隆外源DNA的能力；b.提高對重組體正選擇的特性；c.可通過轉錄作用制備外源DNA插入序列之RNA探針；d.可使插入的真核cDNA與P-半乳糖甘酸形成融合蛋白質；(1)Sp正選擇的£噬菌體載體*1.Spi-正選擇的原理：野生型的大噬菌體不能夠在P2噬菌體溶源性的細菌中生長，其表型為Spi+,即對P2噬菌體的抑制作用呈敏感性(s

19、ensitivetoP2inhibition)實驗證明，這種生長抑制作用是受九噬菌體red和gam這兩個基因編碼產物控制的。如果噬菌體喪失了這兩個基因，(例如被外源插入DNA所取代)，這樣的噬菌體突變體便獲得了Spi-表型，能夠在噬菌體P2溶源性的大腸桿菌細胞中生長并形成噬菌斑。因此，具有red和gam基因的替換型載體(即red和gam基因可被外源插入DNA片段所替代)作克隆實驗，可以按照Spi特性來選擇重組體。因此，Spi-表型為我們提供了一種正選擇標記。*2.選擇標記Spi"表型：不能在P2噬菌體溶源性的E.coli中生長，為非重組體Spi-表型：能夠在P2噬菌體溶源性的E.co

20、li中生長，red和gam基因被外源DNA取代，為重組體失去red和gam這兩個基因的工噬菌體載體，具表型由Spi+Spi-(2)具有體內刪除特性的兀噬菌體載體(1) 土ZAP載體的結構* 1.內刪除載體定義上ZAP載體是一種典型的具有內刪除特性的人噬菌體載體，應用這種載體可在體內將插入的DNA片段直接從九載體轉移到質粒載體上，而無須經過亞克隆的步驟。具有這種特性的載體叫做內刪除載體。圖7-3KZAP載體的結構及具體內刪除作用* 2.>ZAP載體的結構：a.含有一個可以在體內發生刪除作用的pBluescript噬菌粒的DNA片段；b.在pBluescriptDNA兩側含有fl起始子(I)

21、和fl終止子(T);c.在pBluescript噬菌粒內部有一段其兩端分別為T3和T7噬菌體啟動子的多克隆位點MCS區；* 3.pBluescript噬菌粒內刪除原理：體外重組：九ZAP載體+外源DNA片段（形成重組載體）感染：重組載體感染FE.coli菌株，之后再用M13和f1輔助噬菌體超感染反式蛋白質切割作用：在寄主細胞內由輔助噬菌體M13或f1基因II編碼的反式作用蛋白質，識別位于九ZAP載體臂上的f1起始子和終止子，最終導致含有克隆DNA插入序列的pBluescript噬菌粒從九ZAP載體上刪除下來包裝作用與釋放：刪除下來的KZAP被MB蛋白質包裝成單鏈DNA噬菌體顆粒，并被擠壓出寄主

22、細胞。(ii)工ZAP載體的主要特點a.具有多種不同的核酸內切限制酶的單識別位點，可以克隆10Kb大小的外源DNA片段；b.在插入的外源DNA序列取向及讀碼結構均保持正確時，就能從lacZ啟動子表達雜種或融合的蛋白質，并可用抗體篩選；c.在lacZ基因的NH2部位有6個單克隆位點，能發生P-半乳糖甘酶的插入失活效應，故可在Xgal顯色平板上篩選重組體分子；d.利用T3或T7噬菌體的RNA聚合酶，九ZAP能夠轉錄出任何一條鏈的mRNA分子，因此可方便地用來制備外源DNA插入序列的RNA轉錄本。(iii)RNA探針的制備由于MCS區的兩端有一對T3和T7噬菌體的RNA聚合酶啟動子，因此可以利用AZ

23、AP載體在體外制備插入的外源DNA序列之RNA拷貝。實驗操作步驟：選用適當限制酶進行切割使pBluescriptDNA線性化T7RNA聚合酶及4種(NTPs)核甘三磷酸mRNA分子*如果用的NTPs是帶有豆-32P的核甘三磷酸，則可合成高比活性的標記的mRNA分子。4.九重組體DN砌子的體外包裝(1)兒重組體DNA的轉染作用* 1.轉染(transfection漱率定義每微克九DNA轉染寄主細胞所產生的噬菌斑數目，叫做轉染效率；* 2.九DNA的轉染是個低效過程未經任何遺傳操作、新鮮制備的工DNA,其標準的轉染效率也只有105-106之間；而經過基因操作的九DNA,如帶有插入片段等，其轉染效率

24、則更低，一般只有103-104左右，無法滿足實驗要求。* 3.九重組體DNA低效轉染原因分析：載體分子同外源DNA片段之間的結合完全是一種隨機的方式，形成的重組分子中有相當比例是沒有活性的，無法轉染寄主細胞。因此，£重組體DNA對寄主細胞的轉染是一種低效率的過程。(2)九噬菌體的體外包裝* 1.人噬菌體DNA的包裝過程在正常的生長期間，寄主細胞內，一噬菌體要進行特殊的包裝反應，它涉及如下一系列的過程：滾環模型合成多連體形式(concatemericform)DNA,在具備噬菌體頭部前體和A基因產物的條件下，會發生如下反應從COS位點處切割成zDNA單體分子這種線性的九單體DNA分子適

25、于包裝,會很快被裝填到頭部外殼里邊由于具有12bp長的粘性末端，所以這種線性單體的九DNA分子又會重新再環化起來隨后基因D的產物便摻入到完整的頭部，接著通過基因W和FII產物的作用，把頭部和分別組裝的尾部結構連成一體，最終形成成熟的噬菌體顆粒* 2.體外包裝定義在體外試管中完成發生于寄主細胞內的九DNA的全部包裝過程，叫做九DNA的體外包裝。* 3.體外包裝原理K噬菌體的頭部和尾部是分開進行裝配的頭部基因發生突變的噬菌體只能形成尾部；尾部基因發生突變的噬菌體只能形成頭部。將從這兩種不同突變型噬菌體的提取物混合起來，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。*4.互補突變體D基因突變的九phag

26、e、是一對互補的突變型phageE基因突變的九phage/E基因發生琥珀突變（Eam）的兒噬菌體不能形成頭部結構，所以在其感染的寄主細胞中積累大量的尾部蛋白。D基因發生琥珀突變（Dam）的K噬菌體，*QNA不能進入頭部，成熟作用在頭部前體階段受阻。所以在其感染的寄主細胞中，累積大量的頭部蛋白。這兩種溶菌物彼此互補，所以九DNA單體能被包裝成為成熟的噬菌體顆粒。（3）內源DNA包裝的克服：實驗制備的包裝蛋白質提取物，既能包裝外源的DNA（重組體DNA分子），也能包裝內源的DNA。因此在士噬菌體DNA體外包裝中一個重要問題是，要克服內源DNA被包裝的問題。因為正如上述所說，用于制備包裝蛋白的溶源性

27、細菌，它們的原噬菌體被誘發產生的內源DNA同樣也會被包裝起來。克服的辦法是：通過b2區缺失，高效地刪去att位點，抑制在誘發過程中發生原噬菌體的刪除，從而避免了內源DNA被包裝的問題。因此b2突變的原噬菌體之溶源性細菌提取物中，就不會出現內源DNA的包裝問題。避免內源DNA包裝的噬菌體形成噬菌斑，這樣也可達到純化內源本低的目的。例如Imm434溶源性細菌，由于imm434免疫性，就能阻止噬菌斑的形成。選用重組缺陷(red-,rec-)的溶源性細菌，并用紫外線照射誘導法制備溶菌液。這樣便消除了內源DNA的生物學活性，從而克服了令人困擾的內外源DNA間的重組問題。(4)包裝及溶菌的條件*1.cos

28、位點入DNA多連體分子在此處(cos位點)被切割，兩個cos位點之間的人DNA被包裝進噬菌體頭部* 2.Nul及A蛋白質這兩種蛋白是“終止酶”(末端酶)(terminase)的成分，該酶的生物學功能是從cos位點切割KDNA多連體分子。* 3.B,C,D,E及Na3蛋白質這些蛋白質參予噬菌體頭部的構成及組裝* 4.G,H,I,J,K,L,M,T,U,V和Z蛋白質這些蛋白質參予尾部及尾纖維的構成及組裝* 5.R.S.和R2蛋白質S蛋白破壞內膜，R和R2蛋白質協力降解細胞壁以使細胞裂解(lysis)5 .九噬菌體DNA勺包裝限制問題(1)包裝限制的概念九噬菌體頭部外殼蛋白質容納DNA的能力是有一定

29、限度的，上限不超過正常野生型DNA總長的5%,而下限又不得少于正常野生型九DNA總量的75%,也就是說卻筮菌體的包裝能力控制在野生型兒DNA長度的75-105%之間。在這個范圍之內的九DNA可以被包裝成有活性的噬菌體顆粒，而超出這個范圍的就不能形成正常大小的噬菌斑。(2)包裝限制與，一噬菌體的克隆能力包裝限制說明九噬菌體的克隆能力不是無限的，而是有一定的限制。按野生型九phageMW=48kb計算包裝上限=48x105%=51kb而九DNA必要區=28kb51-28=23kb*所以£噬菌體克隆外源DNA的理論極限值是23kb(3)包裝限制的生物學意義包裝限制表明最好采用能增加基因組空

30、間位置的缺失方法構建人噬菌體克隆載體。包裝限制保證正常的重組體方可形成正常的噬菌斑，因此實際上是一種正選擇。6 .九重組體分子的選擇方法由，一噬菌體載體不具抗菌素抗性選擇記號，因此對K重組體分子的選擇除了Spi-正選擇法外，主要依據噬菌斑形態學特征，Xgal-IPTG顯色法進行的。(1)cI基因功能選擇法這是一種根據噬菌斑形態學特征選擇a重組體分子的方法。其原理如下：a. cI基因編碼的阻遏蛋白質，是促使九噬菌體感染的E.coli寄主細胞進入溶源化狀態的必要條件。b. cI基因失活或缺失的九噬菌體是無法使其寄主細胞發生溶源化效應，故形成的是清亮的噬菌斑，而不是混濁的噬菌斑。c.如果在插入型的大

31、噬菌體載體的克隆位點上、或是在替換型的人噬菌體載體的可取代區段中，存在一個cI基因。那么外源DNA的插入或取代，將會使cI基因失活或喪失。d.因此，兒重組體分子的表型將是c，形成清亮型的噬菌斑；非重組體的九DNA分子的表型將是cI+,形成混濁型的噬菌斑。lacZ基因功能選擇法在插入型的九噬菌體載體的lacZ基因序列中，引入了若干常用的核酸內切限制酶位點。當外源克隆的DNA片段插入到這些位點中，形成無功能的P-半乳糖甘酶，于是被感染的E.coli細胞在Xgal-IPTG平板上形成無色的噬菌斑一一重組體克隆。沒有插入外源DNA的非重組體的分子，形成有功能的P-半乳糖甘酶，結果被感染的E.coli細

32、胞在Xgal-IPTG平板上形成藍色的噬菌斑一一非重組體克隆。(3)Spi-選擇法此法在有關章節已作介紹，不再重述。三、柯斯質粒載體1 .柯斯質粒的定義及其構建(1)1噬菌體克隆能力f23Kb一一理論值15Kb一一實際的有效克隆范圍* 1.這樣的克隆能力一般說來是可以容納一個基因包括其非編碼的側翼序列。但許多基因的分子量比較大，特別是真核生物的基因，有的竟達35-40Kb。* 2.八噬菌體作載體往往不能夠同時克隆兩個連鎖基因由此可見，在實際工作中，尤其是關于真核基因結構與功能的研究需要發展出具更大克隆能力的載體。(2)柯斯質粒載體定義1978年，J.Collins和B.Hohn,發展出了柯斯質

33、粒載體(cosmidvectors),在一定程度上滿足了真核生物基因克隆的要求。cosmid=cossite-carryingplasmid粘粒、柯斯體、粘合體，中文譯法不好* 定義：一類由人工構建的帶有九DNA的cos序列和大腸桿菌質粒復制子的特殊類型的質粒載體。(3)柯斯質粒pHC79的構建從pHC79這個名稱起頭字母P,也就說明了cosmid的中文名稱叫柯斯質粒為好。kphage中的cos序列及其控制包裝作用的序列pHC79ypBR322中的完整的復制子：oriTerr基因Ampr基因由此可見，pHC79柯斯質粒兼具了九phagevector和pBR322vector兩方面的優點。(4)

34、柯斯質粒的克隆能力及其組成。柯斯質粒的克隆能力可達45kb柯斯質粒本身分子量較小，典型的是5kb-7kb的環形DNA分子，它由如下4部分組成：f一個質粒的復制起點；一個或數個選擇記號；<大量的限制酶單一識別位點(anumberofuniquerestrictionsites);L一個cos位點(此系包裝的必要條件)；2 .柯斯質粒載體的特點具有兒phage的特性:a.體外包裝后可以高效地轉導敏感的E.colicell;b.導入Cell后的ZDNA線性分子可重新環化起來；c.但無法進入溶菌周期，無法形成子代噬菌體。(2)具有質粒載體的特點：a.具有質粒復制子，可在寄主細胞內像質粒DNA一樣

35、進行復制；b.可在氯霉素作用下擴增，有效提高克隆基因的產量；c.具有抗菌素抗性基因，便于重組體分子的選擇。(3)具有高容量的克隆能力* 1.上面已經提到柯斯質粒只有一個ori、一兩個選擇記號、大量的限制酶的單一識別位點和一個cos位點。因此它的分子比較小，只有5kb-7kb左右，所以它可以克隆大至45kb的外源DNA片段，具低限值為30kb。* 2.Cosmid的克隆能力取決于：能包裝到兒phage頭部的DNA分子量的大小載體本身分子量的大小卬hage可包容高達52kb的DNA,Cosmid自身大小為5-7kb,故其克隆能為45kb-47kb。由于可包裝的KDNA最小為38kb左右，而Cosm

36、idDNA大小一般為5-7kb,故其克隆的下限為30-33kb上下。(4)能夠與帶有同源序列的質粒DNA發生重組作用* 1.共合體的形成一旦柯斯質粒與帶有同源序列的質粒在同一個細胞中共存時，它們之間便可形成共合體(Cointegrant)。因此，若質粒和Cosmid各帶有一個不同的抗藥性記號及相容的復制起點，在轉化至另一個菌株細胞之后，能夠很容易地選擇出含有兩個不同選擇記號的共同體。* 2.共合體的概念由一種具有一個轉位子的復制子，同另一種不具轉位子復制子融合而成的結構。在其兩個復制子結合部位，具有一對同向重復排列的轉位子拷貝。3 .柯斯質粒載體的改良(1)將兩個cos位點組入到同一個柯斯質粒

37、載體上，以簡化在cosmid上的定向克隆(2)構建與通用質粒載體無同源性的柯斯質粒載體在具重組能力的細胞中同時具有這種載體時，它們之間就不會發生重組，但如果它們各帶上同源的外源DNA時，兩者之間就會發生重組形成共合體。使Cosmid帶上由噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動子，這些啟動子可在體外合成克隆的插入片段之任意一端的特異性RNA探針。(4)在Cosmid中加入選擇性記號，以簡化鑒定經重組Cosmid轉染的真核細胞的步驟。(5)在Cosmid中加入真核基因復制起點，以使轉染的Cosmid能夠在哺乳動物細胞中自主復制。(6)在Cosmid中加入原核標記，以促進轉染到哺乳動物細胞內的

38、Cosmid序列在細菌中獲救。(7)用噬菌體復制起點代替質粒復制起點，有證據表明如此可緩解由攜帶ColEI起點的重組Cosmid所造成的生長速度不同的問題。(FromJ.Sambrooketal.1989)P.170中譯本)4 .柯斯克隆(Cosmidcloning)定義應用柯斯質粒作載體，在大腸桿菌寄主細胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術，叫做柯斯克隆。這個定義的三個要點是：a柯斯質粒作載體；b.大腸桿菌為寄主；c.克隆大片段的真核基因組DNA。（2）理論依據a.在九phage線性DNA分子的每一端都具有彼此互補的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端（cos位點）b.九phage的多連體分子是

39、由cos連接而成的。coscoscoscoscoscosIIIIIIc末端酶（treminase咸叫Ter體系即九phage具有一種位點特異的切害1體系（site-specificcuttingsystem）.*此系統能識別兩個相距適宜的（38-54Kb）cos位點，并切割之。*根據上述分析可知人phageDNA包裝的兩個必要條件是:cos位點Ter體系(3)柯斯質粒包裝條件由于只有在被作用的,DNA分子具有兩個cos位點，而且它們之間距離保持在38-54Kb的條件下，Ter體系才能對它發生作用。據此推斷：柯斯質粒是不能作為包裝體系的，因為它只有一個cos位點。因此：柯斯質粒只有在同適當大小的外源DNA片段重組成具有兩個cos位點而且相距達38-54Kb之間時，才能被包裝。(4)柯斯克隆程序真核DNA+限制酶局部消化與消化的柯斯質粒連接重組aa.其中有一部分是兩端具cos位點且相距適宜的重組體b.沒有cos®點的真核DNA片段自身重組體<c.柯斯片段多聚體