1、酸奶中優勢微生物的分離及乳酸菌飲料的制作滕小艷生命科學學院生物科學專業2006級1班 指導老師：宋波摘要：為了解我們日常飲用的酸奶中益生菌的基本情況，本次實驗通過酸奶的制作，菌種的活化，傳代，分離鑒定和平板劃線等方法，對其中的2種菌進行鏡檢和革蘭氏染色以確定其類型，；然后用1種或2種等量混合的方法，發酵制成的產品，比較其發酵性能。結論：在瓊脂培養基上，圓形稍扁平的黃色菌落，及其周圍培養基變為黃色者，即為乳酸菌。乳酸菌根據細胞為球狀或桿狀，可分為兩大類，即為乳酸鏈球菌和乳酸桿菌族。嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵的酸奶風味明顯優于嗜酸乳桿菌單獨發酵。凝乳時間也大為縮短。關鍵字：保加利亞乳桿菌 嗜酸

2、乳桿菌 嗜熱鏈球菌 革蘭氏染色 混合發酵Yogurt microorganisms and lactobacillus drink productionTengXiaoYanLife science college of biological science class 1 grade 2006 ，instructor: song boAbstract: in order to understand our everyday drinkable probiotic yogurt, the basic condition of this experiment through, yogurt, s

3、trains of activation, separation and identification of flat nestin crossed, the method of the two kinds of bacteria for gram's staining and to determine the types. Then use one or two equal mixing method, fermented product, compares the performance of fermentation.Conclusion: in AGAR medium, cir

4、cular slightly flat yellow, and its surrounding medium colony, to become yellow lactobacillus. According to the cells to aspen, globular or can be divided into two categories, namely, streptococcus and lactobacillus to lactic acid. Acidophilus andKey words：Bulgaria lactobacillus acidophilus streptoc

5、occus thermophilus cultured mixed fermentation gram's staining.嗜酸乳桿菌存在于人類和一些動物的小腸內，它在代謝過程中產生能產生乳酸過氧化氫乳酸殺菌素和類細菌素，從而抑制腸道內有害菌的生長，調整胃腸環境，同時嗜酸乳桿菌還有防治結腸癌和降低體內膽固醇的作用。由于嗜酸乳桿菌優良的保健功能及耐酸和耐膽汁的特點，因而被稱為第三代乳酸發酵劑，發展前景十分廣闊，但嗜酸乳桿菌的生產特性差，凝乳時間長，風味口感不好，本研究利用球菌和桿菌之間相互促進的共生作用，將嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合培養，以求得最佳的生產效果，從實驗結果可以看出：兩種菌

6、混合的產酸能力要高于單獨培養。影響凝乳時間各個因素的主次順序為：其中接種量對對凝乳時間的影響要遠遠大于其它三個因素。影響產品感官評定指標各個因素的主次順序為：其中加糖量對感官評定指標的影響最大，其次為接種量和培養溫度，菌種配比的影響最小。綜合考慮各因素對凝乳時間和感官評定的影響后得出和混合發酵生產酸奶的最佳工藝參數：接種量，加糖量，培養溫度。1 材料和方法1.1材料1.1.1培養基BCG牛乳培養基：A溶液脫脂乳粉100g，水500ml,加入溴甲酚綠（BCG）乙醇溶液1ml,80滅菌20min,B溶液酵母膏10g，水500ml,瓊脂20g,PH6.8,121濕熱滅菌20min,以無菌操作趁熱將A

7、B溶液混合后倒平板。細菌培養基1.成分：牛肉膏0.5g,蛋白胨1.0g,NACL0.5g,蒸餾水100ml,PH7.27.5。2.制法：加熱溶解，調PH值，分裝于三角瓶中121,20min高壓滅菌。脫脂乳試管直接選用脫脂乳液或脫脂乳粉與5%蔗糖水為1：10的比例配制，裝量以試管的1|3為宜，115滅菌15min。1.1.2原料，脫脂乳粉，全脂滅菌的純牛奶1L，蔗糖。1.1.3儀器及用具：恒溫水浴鍋，酸度計，高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，培養箱，酸乳瓶（200300ml），滅菌的平板培養皿，300ml三角瓶，試管，移液管。1.2方法1.2.1制備平板培養基配BCG溶液，0.8gBCG加入50ml

8、20%乙醇中，其中20%乙醇由25ml 95%的酒精+75ml蒸餾水制成，然后配A溶液B溶液，分開滅菌，各500ml,在無菌操作臺上趁熱將A溶液B溶液混合均勻后，倒平板30個。1.2.2制備稀釋液（無菌操作）將混合菌種在無菌操作臺上倒入1L的全脂滅菌的純牛奶中，蓋好蓋子，在37恒溫培養箱中培養68h,再取出，用手搖動，感覺是否變稠狀。然后用滅菌的移液管取0.5ml放入4.5ml無菌水的試管中，依次稀釋到10-5，取10-410-5兩個稀釋度的稀釋液各0.10.2ml，分別接入BCG牛乳培養基瓊脂平板上各5個平板，用無菌涂布器依次涂布;或者直接用接種環蘸取原液平板劃線分離，置40培養48h,將接

9、種好的培養皿倒置，即平皿蓋朝下放置。用于進一步純化分離或直接轉接斜面，1.2.2 平板劃線分離微生物1.2.2.1 倒平板 按無菌操作要求，在酒精燈火焰旁邊操作，取融化并冷卻至不燙手的培養基，倒入無菌培養皿中，倒量以鋪滿皿底為限，平放桌上待其充分凝固，備用。1.2.2.2 劃線分離 使用接種環，分別從10-410-5兩個稀釋度所倒的平板培養基中挑取不同的單菌落，在相應培養基平板中劃線分離，劃線的方法多樣，依次編號為A1-A5，然后將接種好的培養基倒置，于40中恒溫培養48h。11.2.3 微生物的復篩培養3天后再按照平板劃線的方法從A1-A5培養基中挑取單菌落接種到相應的平板培養基，依次編號為

10、B1-B5，然后將接種好的培養基倒置，于40中恒溫培養48h。1.2.4 微生物的鏡檢及鑒定1.2.4.1 觀察菌落的基本形態從各培養基中選取不同的單菌落，觀察其形狀及顏色，并記錄。1.2.4.2 觀察該菌株的活菌（常用壓滴法）首先將潔凈無油膩的載片放于自己右邊前方，在中央放一小滴無菌水。將酒精燈放于自己的正前方，點燃。然后用無菌操作方法挑取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻,把接種環上殘留的菌體殺滅后，放回試管架。接著用鑷子取一潔凈的載玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個蓋玻片慢慢放下，注意不要產生氣泡。如菌液過多，可用吸水紙吸去一部分。先用低倍鏡然后轉用高倍鏡觀察，觀察時光線要適當調暗些。2

11、1.2.4.3菌種的鑒定選取乳酸菌典型菌落轉至脫脂乳試管中，40培養824h，若牛乳出現凝固，無氣泡，呈酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種均分別選入），革蘭氏染色呈陽性，則可將其連續傳代46次，最終選擇出在36h能凝乳的牛乳管，作菌種待用。1.2.5 .乳酸菌的飲料的制作1.2.5.1將脫脂乳和水以1：710（W/V）的比例，同時加入5%6%蔗糖，充分混合，于8085滅菌1015min，然后冷卻至3540，作為制作飲料的培養基質。將純種嗜熱鏈球菌嗜酸乳桿菌及兩種菌的等量混合菌液作為發酵劑3，均以2%5%的接種量分別接入以上培養基基質中即為飲料發酵液，亦可以市售鮮酸乳為發酵劑。接種后

12、搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的飲料發酵液重復分裝35瓶，隨后將瓶蓋擰緊密封。1.2.5.2把接種后的酸乳瓶置于4042恒溫培養箱中培養34h。培養時注意觀察，在出現凝乳后停止培養。然后轉入45的低溫下冷藏24h以上。經此后熟階段，達到酸乳酸度適中(PH4.04.5)，凝塊均勻致密，無乳清析出，無氣泡，獲得較好的口感和特有風味。1.2.5.3以品嘗為標準評定酸乳質量 采用乳酸球菌和乳酸桿菌等量混合發酵的酸乳與單菌株酸乳發酵的酸乳相比較，前者的香味和口感更佳。品嘗時若出現異味，表明酸乳污染了雜菌。比較項目見表2。1.2.6 微生物的生理生化性質的測定1.2.6.1 革蘭氏染色首先制片、涂

13、菌 ，用無菌操作方法分別從試管中沾取菌種一環，用接種環在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻，直徑約1cm的菌膜，涂菌后接種環火焰滅菌。干燥 于空氣中自然干燥.亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥（溫度不宜過高）。固定 目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上,便于顏料著色，常用加熱法，即將細菌涂片膜向上，通過火焰三次，以熱而不燙為宜,防止菌體燒焦、變形，此制片可用于染色。初染 于制片上滴加結晶紫染液染，1分鐘后，用水洗去剩余染料。媒染 滴加盧戈氏碘液，1分鐘后水洗。脫色 滴加95乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止（根據涂片之厚薄需時30秒至1分鐘），水洗。復染 滴加石炭酸復紅液復染1分鐘，水洗。

14、用濾紙吸干，油鏡鏡檢。最后觀察并記錄結果1.2.7發酵性能的測定4將分離得到的4株菌以5%的比例接種于無菌脫脂乳培養基中，37恒溫培養箱中發酵8h，冷卻并在冰箱中冷藏（4）10h后定各指標。滴定酸度的測定：取待測酸乳樣品，用濃度為10g|L的氫氧化鈉溶液測定滴定酸度；PH值的測定：取待測酸乳樣品，用ZD-2型自動電位測定儀測定PH值；黏度的測定：取酸乳樣品中用NDJ-8S型數顯黏度計測定黏度；保水率的測定：在離心管中各放入質量W為10g的酸乳，于3000r|min離心10min。 2.結果與分析2.1酸奶中微生物的的稀釋分離恒溫箱培養后1-5號培養基上面都有菌落長成，根據菌落形態初步判斷有乳酸

15、菌。2.2平板劃線分離微生物劃線分離后恒溫培養結果：各培養基上均有單菌落生成。 2.3 微生物的復篩各培養基上長出的菌落形態顏色較為均一，可以作為下一步實驗的對象，其他培養基上的菌落差異較大。2.4 微生物的鏡檢及鑒定（1） 保加利亞桿菌細胞形態長桿狀，兩端鈍圓。固體培養基生長的菌落呈棉花狀。易于其他乳酸菌區別。能利用葡萄糖果糖乳糖進行同型乳酸發酵產生D型乳酸（又酸澀味，適口性差），不能利用蔗糖3。該菌是乳酸菌中產酸能力最強的菌種，其產酸能力與菌體形態有關，菌形越大，產酸越多，最高產酸量2%。如果菌形為顆粒狀或細長鏈狀，產酸較弱，最高產酸量1.3%2.0%。蛋白質分解能力較弱。發酵乳中可產生香

16、味物質乙醛，最適生長溫度3745，溫度高于50或低于20不生長。常作為發酵酸奶的生產菌。（2） 嗜酸乳桿菌細胞形態比保加利亞桿菌小，呈細長桿狀，能利用葡萄糖果糖乳糖和蔗糖進行同型乳酸發酵產生D型乳酸，生長繁殖需要一定的維生素等生長因子，37培養生長緩慢，23d可使牛乳凝固。因而在發酵劑制造及嗜酸菌乳生產中，常在原料中加入5%的番茄汁或胡蘿卜汁。蛋白質分解能力較弱。最適生長溫度37，20以下不生長，耐熱性差。最適生長PH5.56.0，耐酸性強，能在其他乳酸菌不能生長的酸性環境中生長繁殖。（3） 嗜熱鏈球菌。細胞形態呈長鏈球狀，無鞭毛，不產芽孢，單個或呈鏈狀排列，在瓊脂培養基上培養48h，菌落呈奶

17、黃色，圓形，規則，較濕潤，直徑約0.61.0mm，表面光滑，質地均勻。某些菌落若不經過中間牛乳培養則在固體培養基上得不到菌落；能利用葡萄糖果糖乳糖和蔗糖進行同型乳酸發酵產生L型乳酸。在石蕊牛乳中不還原石蕊，可使牛乳凝固。蛋白質分解能力較弱。在發酵乳中可產生香味物質雙乙酰。該菌主要特征是能在高溫條件下產酸。最適生長溫度4045，溫度低于20不產酸。耐熱性強，能耐6568的高溫8。常作為發酵酸乳瑞士干酪的生產菌。（4）雙歧桿菌最適生長溫度3741，最低生長溫度2528，最高4345。初始最適PH 6.57.0,在PH4.55.0或8.08.5不生長。其細胞呈現多樣形態，有短桿較規則形纖細桿狀具有尖

18、細末端形球形長桿彎曲形分枝或分叉形棍棒形或匙形。單個或鏈狀V形柵欄狀排列，或聚集成星狀。革蘭氏染色陽性，不抗酸，不形成芽孢，不運動。雙歧桿菌的菌落光滑凸圓邊緣完整乳脂至白色閃光并具有柔軟的質地。2.5 微生物的生理生化性質的測定2.5.1 革蘭氏染色 革蘭氏染色反應的機理，主要由于這兩類細菌細胞壁的機構和組成不同決定的。實際上，當用結晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有的細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成、壁厚、類脂質含量低，

19、用乙醇脫色時細胞壁脫水，使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫碘的復合物不易被洗脫而被保留到細胞內，經脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。該菌株革蘭氏染色呈藍紫色，故其為革蘭氏陽性菌。表1 感官評定評分 百分制口感（30分）具有酸奶特有的細膩潤滑及稠厚感爽口2530；較細膩潤滑稠厚感不強或稀薄1524；較為粗糙，有砂粒狀或砂狀口感，或如飲水狀<15;滋味和氣味(40分)有發酵乳特有的滋氣味酸

20、甜適口風味協調3540；風味較淡酸甜可口，勉強接受2034；風味淡薄氣味不協調，不能接受<20組織狀態（30分）凝乳均勻，無雜質，無或有少量乳清析出2530；凝乳較均勻，有乳清析出1524；凝乳不均勻，乳清析出嚴重<15；表二 乳酸菌單發酵及混合發酵的酸乳品評結果品評項目 乳酸菌類凝乳情況口感香味異味嗜酸乳桿菌 凝乳時間長凝乳不均勻，乳清析出嚴重較為粗糙，有砂粒狀或砂狀口感，或如飲水狀。風味淡薄。氣味不協調，不能接受。嗜熱鏈球菌凝乳時間較短，凝乳較均勻，有乳清析出。較細膩潤滑稠厚感不強或稀薄。風味較淡酸甜可口。勉強接受。球菌桿菌混合1：1凝乳時間也大為縮短，凝乳均勻，無雜質，無或有

21、少量乳清析出。具有發酵乳特有的滋氣味酸甜適口風味協調。酸甜適口。風味協調。結論：嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵的酸奶風味明顯優于嗜酸乳桿菌單獨發酵，凝乳時間也大為縮短。3.酸奶生產過程中常出現的問題及解決方法3.1酸乳硬度不夠，稀薄或黏糊狀原料乳中蛋白質含量不足，發酵劑接種量過少，發酵時間偏低，原料乳的熱處理和均質處理不夠恰當，這些都會影響酸乳的質地和結構。應該調整原料乳配方，增加蛋白質含量，避免提前攪拌，適當增加穩定劑用量。3.2產酸緩慢原料乳中含有抗生素，原料乳干物質含量低，原料乳中雜菌數高，菌種基因發生負突變，對凍干菌種活化傳代次數不夠而尚未恢復活力，乳中含有其它抑菌物質，這些都會導致酸

22、乳發酵劑產酸緩慢。應該在生產酸乳前對原料乳中的抑菌物質或抗生素進行嚴格檢測，發酵劑要嚴格按要求進行無菌操作，并盡可能在標準條件下培養，制備好的發酵劑要進行菌種活力鑒定，根據其活力調整生產接種量，并適當控制培養溫度。3.3芳香味不夠酸乳口味與菌種種類原料乳品質密切相關，同樣型號的菌種采用不同的原料乳，可以生產出口味截然不同的酸奶，反之，同樣的原料乳采用不同型號的菌種，也可以生產風味迥異的酸奶，這與不同的菌種構成有關。解決酸乳芳香味不夠的措施是，在確保原料乳品質沒有缺陷的前提下，采用適合當地消費者口味的菌種或調整球菌與桿菌比例，延長發酵時間，適當增加發酵溫度，增加乳固形物含量，減少菌種產黏能力，確

23、保發酵乳酸化到足夠的酸度并進行發酵，使菌種的風味物質能充分產生。3.4乳清析出嚴重乳清析出是酸乳中最常見，也是最容易產生的現象。引起乳清析出的原因就是原料和發酵劑。對于因原料影響而產生的乳清析出，可以對原料進行標準化處理，即加大原料中固形物含量，加入脫脂乳粉或對原料進行濃縮，要求原料乳的酸度在18.T以下，雜菌數不得高于50*10·4cfu/ml，均質處理可使原料充分混勻；對于因發酵劑的菌種老化活力弱，使得發酵時間延長，乳清析出嚴重的問題，可以使用直投式發酵劑加以解決。4.討論與展望：嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵的酸奶風味明顯優于嗜酸乳桿菌單獨發酵，凝乳時間也大為縮短，雖然傳統酸奶

24、生產中保加利亞桿菌和嗜熱球菌的比例 1：1 ，考慮到嗜酸乳桿菌產香，產酸能力較弱，所以桿菌和球菌的比例為 2：1 是適合的，接種量對酸奶生產及品質的影響非常明顯，加大接種量可以縮短乳酸菌生長的延遲期，提高產酸速度，縮短凝乳時間，但對于產品風味而言，接種量過大會產生不利影響。一般認為，接種量小有利于球菌生長，接種量大有利于桿菌生長。為了酸奶特殊風味的形成，球菌或桿菌的生長都不易過于旺盛，實驗顯示接種量小時產品風味最佳。生產酸奶時，加入適當的蔗糖可使產品具有良好風味，凝塊細膩光滑。從實驗結果可以看到，隨著加糖量的提高凝乳時間隨之延長，這說明蔗糖濃度過高抑制了嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長，但對于感官

25、品質，加糖量越大，評分越高。為了增加嗜酸乳桿菌發酵乳的適口性，適當提高加糖量是應該的，培養溫度對酸奶生產和品質的影響很大，嗜酸乳桿菌的最適生長溫度為 37，和嗜熱鏈球菌的最適生長溫度為45 ，從數據分析中看到培養溫度越高，凝乳時間越短，產品風味越差，經過綜合考慮，我們把最佳溫度定在中間水平即40。參考文獻：1沈萍，范秀容，李廣斌微生物學實驗(第三版)M北京：高等教育出版社， 1999214-2222李順鵬微生物學實驗指導M北京：中國農業出版社，2003：58-703 王淑軍，韋友兵，潘元兵.酸乳制品種乳酸菌分離篩選方法研究J.淮海工學院學報（自然科學版）,1997,9(6)：32-34.4 凌

26、代文.乳酸細菌分離鑒定及實驗方法M.北京：中國輕工業出版社，1999.5 呂兵，張國農，肖光輝.新型酸奶發酵劑的研究J.中國乳品工業, 1999，27（5）：27-29.6 汪川，張朝武，余倩.酸奶中保加利亞乳桿菌分離條件的優化J.中國微生態學雜志, 2001， 4（13）：73-75.7 孟和畢力格，李少英，雙杰. 酸奶制品中乳酸菌的分離鑒定與發酵性能的研究J. 中國乳業，2001（10）：15-18.8 周家春. 乳酸菌菌種的簡便分離和培養.食品科學, 1998，19（1）：39-419 Altieri, C; Bevilacqua, A; D'Amato, D; Nobile, MAD; Sinigaglia, M：Modelling