1、核酸序列的一般分析核酸序列的一般分析u 分子量（分子量（molecular weight）確定確定DNA序列的分子量和堿基組成序列的分子量和堿基組成v 單鏈單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）v 雙鏈雙鏈DNA（double strand DNA，dsDNA）u 堿基組成（堿基組成（composition）v 各種堿基數(shù)量各種堿基數(shù)量v 各種堿基比例各種堿基比例u 分析舉例分析舉例從美國從美國North Carolina State University微生物系的網(wǎng)頁（微生物系的網(wǎng)頁（/BioEdit/bioedit.htm

2、l）下載）下載BioEdit分析工具分析工具在本地計(jì)算機(jī)上利用在本地計(jì)算機(jī)上利用BioEdit工具進(jìn)行分析工具進(jìn)行分析打開要分析序列的文件并打開要分析序列的文件并copy序列，在序列，在BioEdit分析工具的分析工具的“File”欄目選擇欄目選擇“New from Clipboard”粘貼序列粘貼序列選擇選擇被粘貼序列被粘貼序列的名稱，在的名稱，在“Sequence”欄目點(diǎn)擊欄目點(diǎn)擊“Nucleic AcidNucleotide Composition”文字文字分析結(jié)果和分析結(jié)果和圖形圖形結(jié)果結(jié)果 （二）序列變換（二）序列變換AAAAATGGCCATGGGTCCACACGCAGTGAGATG

3、AATGCTAGATCTCACGAGA AAAAATGGCCATGGGTCCACACGCAGTGAGATGAATGCTAGATCTCACGAGA 原始原始DNA序列序列TTTTTACCGGTACCCAGGTGTGCGTCACTCTACTTACGATCTAGAGTGCTCTTTTTTACCGGTACCCAGGTGTGCGTCACTCTACTTACGATCTAGAGTGCTCT互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列（complement)AGAGCACTCTAGATCGTAAGTAGAGTGACGCACACCTGGGTACCGGTAAAAAAGAGCACTCTAGATCGTAAGTAGAGTGACGCACACCTGGG

4、TACCGGTAAAAA反向序列反向序列（reverse)TCTCGTGAGATCTAGCATTCATCTCACTGCGTGTGGACCCATGGCCATTTTTTCTCGTGAGATCTAGCATTCATCTCACTGCGTGTGGACCCATGGCCATTTTT反向互補(bǔ)序列反向互補(bǔ)序列（reverse complement)AAAAAUGGCCAUGGGUCCACACGCAGUGAGAUGAAUGCUAGAUCUCACGAGAAAAAAUGGCCAUGGGUCCACACGCAGUGAGAUGAAUGCUAGAUCUCACGAGARNA序列序列u DNADNA序列之間變換序列之間變換u DN

5、ARNA序列之間變換序列之間變換v 分析方法（舉例）分析方法（舉例）在本地計(jì)算機(jī)上利用在本地計(jì)算機(jī)上利用BioEdit工具進(jìn)行分析工具進(jìn)行分析打開要分析序列的文件并打開要分析序列的文件并copy序列，在序列，在BioEdit分析工具的分析工具的“File”欄目選擇欄目選擇“New from Clipboard”粘貼序列粘貼序列選擇選擇被粘貼序列被粘貼序列的名稱，在的名稱，在“Sequence”欄目點(diǎn)擊欄目點(diǎn)擊“Nucleic AcidComplete”獲得互補(bǔ)序列、獲得互補(bǔ)序列、“Nucleic AcidReverse Complete”獲得反向互補(bǔ)序列、獲得反向互補(bǔ)序列、“Nucleic A

6、cidDNA-RNA”獲獲得得RNA序列序列在在“Edit”欄目選擇欄目選擇“Copy Sequence to clipboard (Fasta Format)”將獲得的序列粘貼到另一個(gè)文件將獲得的序列粘貼到另一個(gè)文件u DNA蛋白質(zhì)序列之間變換蛋白質(zhì)序列之間變換AAAAATGGCCATGGGTCCACACGCAGTGAGATGAATGCTAGATCTCACGAGAAAAATGGCCATGGGTCCACACGCAGTGAGATGAATGCTAGATCTCACGAG K N G H G S T R S E M N A R S H EK N G H G S T R S E M N A R S H

7、E閱讀框閱讀框 1K M A M G P H A V R K M A M G P H A V R * * M L D L T R M L D L T R閱讀框閱讀框 2K W P W V H T Q K W P W V H T Q * * D E C D E C * * I S R I S R閱讀框閱讀框 3v 分析方法翻譯全長分析方法翻譯全長DNA序列（舉例序列（舉例1）在本地計(jì)算機(jī)上利用在本地計(jì)算機(jī)上利用BioEdit工具進(jìn)行分析工具進(jìn)行分析打開要分析序列的文件并打開要分析序列的文件并copy序列，在序列，在BioEdit分析工具的分析工具的“File”欄目選擇欄目選擇“New from

8、Clipboard”粘貼序列粘貼序列選擇選擇被粘貼序列被粘貼序列的名稱，在的名稱，在“Sequence”欄目點(diǎn)擊欄目點(diǎn)擊“Nucleic AcidTranslate Frame 1”獲得氨基酸序列獲得氨基酸序列分析分析結(jié)果結(jié)果利用BioEdit軟件示例v 分析方法翻譯選擇的分析方法翻譯選擇的DNA序列區(qū)段（舉例序列區(qū)段（舉例2）在在SRS檢索主頁（檢索主頁（http:/srs.ebi.ac.uk）點(diǎn)擊）點(diǎn)擊“Tools”在在Tool網(wǎng)頁網(wǎng)頁選擇選擇“Nucleic ToolsNucleic Translation Transeq”，點(diǎn)擊，點(diǎn)擊“Launch”在在Transeq網(wǎng)頁網(wǎng)頁選擇閱讀框

9、和遺傳密碼類型，輸入編碼區(qū)，粘選擇閱讀框和遺傳密碼類型，輸入編碼區(qū)，粘貼序列貼序列分析分析結(jié)果結(jié)果選擇閱讀框 和遺傳密碼類型v 分析方法翻譯選擇的分析方法翻譯選擇的DNA序列區(qū)段，顯示序列區(qū)段，顯示DNA和氨基酸和氨基酸序列（舉例序列（舉例3）在在SRS檢索主頁（檢索主頁（http:/srs.ebi.ac.uk）點(diǎn)擊）點(diǎn)擊“Tools”在在Tool網(wǎng)頁網(wǎng)頁選擇選擇“Nucleic ToolsNucleic Translation ShowseqN”，點(diǎn)擊，點(diǎn)擊“Launch”在在ShowseqN網(wǎng)頁網(wǎng)頁在在“display format”欄目選擇欄目選擇“one frame translati

10、on”、選擇閱讀框和遺傳密碼類型，輸入編碼區(qū)，粘、選擇閱讀框和遺傳密碼類型，輸入編碼區(qū)，粘貼序列貼序列分析分析結(jié)果結(jié)果序列格式轉(zhuǎn)化序列格式轉(zhuǎn)化 各種軟件為了自己的需要，通常對序列格式各種軟件為了自己的需要，通常對序列格式有一定的要求，給我們的使用帶來了一定的困難。有一定的要求，給我們的使用帶來了一定的困難。格式轉(zhuǎn)換軟件可以將不同格式數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以方便使格式轉(zhuǎn)換軟件可以將不同格式數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以方便使用。很多綜合性軟件可以進(jìn)行序列格式轉(zhuǎn)換，如用。很多綜合性軟件可以進(jìn)行序列格式轉(zhuǎn)換，如DNAstar，seqverter等。等。 常見序列格式：常見序列格式：（1）FASTA格式格式： 又稱又稱Pearson格

11、式。是比較格式。是比較簡單而使用最多的序列格式。序列以簡單而使用最多的序列格式。序列以“”號開號開頭，其后是單行的關(guān)于序列的描述信息，最后頭，其后是單行的關(guān)于序列的描述信息，最后是序列。是序列。 例子：例子： 10KD_VIGUN P18646 vigna unguiculata 10 kda protein precursor MEKKSIAGLCFLFLVLFVAQEVVVQSEAKTCENLVDTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLLS （2）plain text格式格式 是一個(gè)形式最簡單的格式，是一個(gè)形式最簡單的格式，沒有任何的注釋，每行沒有任何的注釋，每行60個(gè)字母，使用標(biāo)準(zhǔn)核

12、個(gè)字母，使用標(biāo)準(zhǔn)核甘酸符號或標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸的單字母符號。例如：甘酸符號或標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸的單字母符號。例如： MEKKSIAGLCFLFLVLFVAQEVVVQSEAKTCENLVDTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLLS （3）GCG格式格式 是商業(yè)性的是商業(yè)性的GCG軟件包的專用格軟件包的專用格式，例如：式，例如： 1 ggagactttc ctgtcactgg ctactactac tcccaaccct cctcaaagcc gccggagcaa1 ggagactttc ctgtcactgg ctactactac tcccaaccct cctcaaagcc gccggagcaa 61

13、cccccaggtc tttactttac aatcggcaat ttgacttgct ctgctgcatg tctggaggga 61 cccccaggtc tttactttac aatcggcaat ttgacttgct ctgctgcatg tctggaggga121 ccaaggaaag tgtggagacg ctccaaggat taggtgatcg gagcttgaaa agaaaaaaag121 ccaaggaaag tgtggagacg ctccaaggat taggtgatcg gagcttgaaa agaaaaaaag（4）Genbank格式格式 例如：例如：LOCUS A

14、B094638_1 146 bp DNA 13-APR-2006LOCUS AB094638_1 146 bp DNA 13-APR-2006BASE COUNT 38 a 17 c 43 g 48 t 0 othersBASE COUNT 38 a 17 c 43 g 48 t 0 othersORIGIN ORIGIN 1 gttttaatgt gttgccttgg ttgagtggtg aagctggtta gggtagcgtg taaaacatgg 1 gttttaatgt gttgccttgg ttgagtggtg aagctggtta gggtagcgtg taaaacatgg 6

15、1 tgggtagatt aatgctttgt gtcaccatgc cgtttggttc gattaatgta atcataagga 61 tgggtagatt aatgctttgt gtcaccatgc cgtttggttc gattaatgta atcataagga 121 gagaccataa gttatgaata cgcaga 121 gagaccataa gttatgaata cgcaga(5) PIR格式格式DL;OsNIP1-1ATGGCAGGAGGTGACAACAACTCCCAGACCACCAATGGCGGCTCAGGTCACGAGCAGAGAGCCATGGAGGAAGGCA

16、GGAAGCAGGAGGAGTTCGCCGCCGACGGCCAGGGCTGCGGCCTCGCCTTCTCCGTCCCTTTCATCCAGAAGATCATCGCGGAGATCTTTGGGACATACTTCTTGATCTTCGCGGGGTGCGGGGCGGTGACGATCAACCAGAGCAAGAACGGGCAGATCACGTTCCCGGGGGTGGCGATCGTGTGGGGGCTGGCGGTGATGGTGATGGTGTACGCCGTGGGGCACATCTCCGGCGCGCACTTCAACCCCGCGGTGACGCTGGCGTTCGCGACGTGCCGGAGGTTCCCTTGGCGGCAGGTGC

17、CGGCGTACGCGGCGGCGCAGATGCTGGGCGCCACCCTCGCCGCCGGCACGCTCCGGCTCATGTTCGGCGGCCGCCACGAGCACTTCCCCGGCACGCTCCCCGCCGGCTCCGACGTGCAGTCGCTCGTCCTCGAGTTCATCATCACCTTCTACCTCATGTTCGTCATCTCCGGCGTCGCCACCGACAACCGAGCCATCGGGGAGCTGGCAGGGCTGGCCGTTGGTGCAACCATCCTGCTTAACGTGCTGATTGCTGGGCCGATCTCGGGAGCATCGATGAACCCGGCTCGGAGCCTGGGGC

18、CGGCGATGATCGGCGGCGAGTACAGGTCGATCTGGGTGTACATCGTCGGGCCGGTCGCCGGCGCGGTGGCCGGAGCTTGGGCCTACAACATCATCCGCTTCACCAACAAGCCCCTCCGGGAGATCACCAAGAGCGGCTCCTTCCTCAAGAGCATGAACCGGATGAACTCCTCCACCTAA*最新下載最新下載 http:/ *下載后直接安裝即可下載后直接安裝即可SeqverterPIRKa/KsPhylipphylogenetic treeMSFGeneDocPAUPPAUP tree construction序列翻譯、序列翻譯

19、、ORF查找查找 對于一條新的核酸序列，除了對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行類對于一條新的核酸序列，除了對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行類似性檢索和同源性比較外，還有許多其他分析內(nèi)似性檢索和同源性比較外，還有許多其他分析內(nèi)容。例如：計(jì)算容。例如：計(jì)算DNA的堿基組成、檢索內(nèi)部重復(fù)的堿基組成、檢索內(nèi)部重復(fù)序列、檢索序列、檢索DNA的特殊位點(diǎn)或信號、開放讀框的的特殊位點(diǎn)或信號、開放讀框的查找、鑒定查找、鑒定DNA的編碼區(qū)和翻譯基因序列等。的編碼區(qū)和翻譯基因序列等。 基因編碼區(qū)是指可以由核糖體翻譯成蛋白質(zhì)的序列，基因編碼區(qū)是指可以由核糖體翻譯成蛋白質(zhì)的序列，它的它的5端有轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始位點(diǎn)，端有轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始位點(diǎn)，3端有終止位點(diǎn)。基端

20、有終止位點(diǎn)。基因的起始位點(diǎn)通常是因的起始位點(diǎn)通常是ATG，終止位點(diǎn)為，終止位點(diǎn)為TAA、TAG、TGA。 一個(gè)起始和終止密碼子之間的序列稱為一個(gè)開放閱讀一個(gè)起始和終止密碼子之間的序列稱為一個(gè)開放閱讀框（框（Open Reading Frame，簡稱，簡稱ORF），它是一個(gè)潛在），它是一個(gè)潛在的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。序列翻譯、序列翻譯、ORF查找查找Generunner http:/ finder /gorf/gorf.htmlGetorf http:/cbi.labri.fr/outils/Pise/getorf.htmlPlotor

21、f http:/bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/plotorf.htmlBestORF http:/ http:/ 序列編輯與類似序列查找、建立自己的序列數(shù)序列編輯與類似序列查找、建立自己的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找、序列比較、序列翻譯、蛋白序列據(jù)庫進(jìn)行查找、序列比較、序列翻譯、蛋白序列分析等，還包括分析等，還包括DNA分析常用到的一些功能，如分析常用到的一些功能，如堿基百分組成、分子量計(jì)算等。堿基百分組成、分子量計(jì)算等。Generunner /gorf/gorf.htmlORF finder輸入序列輸入序列

22、在在Enter GI or ACCESSION 后面的框中輸入公共序列后面的框中輸入公共序列的的gi號或號或ACCESSION號號在在or sequence in FASTA format 后面的框中輸入完后面的框中輸入完整的序列整的序列設(shè)置序列范圍設(shè)置序列范圍 在在FROM: TO: 后面的框中輸入進(jìn)行后面的框中輸入進(jìn)行ORF查找的序列范圍查找的序列范圍Genetic codes 可以選擇采用何種遺傳編碼可以選擇采用何種遺傳編碼按按OrfFind 按鈕即可執(zhí)行按鈕即可執(zhí)行http:/cbi.labri.fr/outils/Pise/getorf.html根據(jù)預(yù)測結(jié)果，同時(shí)參考序列比對(bla

23、stx)結(jié)果。一般選擇最長的ORF可選擇特異的物種限制性內(nèi)切酶分析限制性內(nèi)切酶分析 每一種限制性內(nèi)切酶都有特定的DNA識(shí)別順序，并且呈回文排列。確定確定DNA酶切位點(diǎn)是基因操作的必不可少的步驟酶切位點(diǎn)是基因操作的必不可少的步驟:(1)在進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性（在進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和）和cDNA擴(kuò)增片段長擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（度多態(tài)性（cDNA-AFLP）分析時(shí)，試驗(yàn)前要對所有目的基因進(jìn)）分析時(shí)，試驗(yàn)前要對所有目的基因進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶酶切的理論分析，初步確定條帶的長度和多行限制性核酸內(nèi)切酶酶切的理論分析，初步確定條帶的長度和多態(tài)性；態(tài)性；(2)在基因克隆時(shí)，要對目的基因片段

24、和載體進(jìn)行酶切分析，以在基因克隆時(shí)，要對目的基因片段和載體進(jìn)行酶切分析，以選擇適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶對克隆位點(diǎn)進(jìn)行酶切；選擇適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶對克隆位點(diǎn)進(jìn)行酶切；(3)可以通過序列分析，預(yù)測酶切位點(diǎn)的位置和酶切位點(diǎn)的特征。可以通過序列分析，預(yù)測酶切位點(diǎn)的位置和酶切位點(diǎn)的特征。 因此DNA序列分析軟件包大多整合有檢索酶切位點(diǎn)的程序。這些程序附帶一個(gè)酶切位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫文件，根據(jù)這個(gè)文件對序列作酶切位點(diǎn)的查找。限制性內(nèi)切酶分析常用工具限制性內(nèi)切酶分析常用工具 常用的軟件有常用的軟件有BioEdit，DNAstar， DNAssist， DFW 2.21， Generunner， DNAMAN，Ve

25、ctor NTI，BioXM等。等。 在線網(wǎng)站如在線網(wǎng)站如http:/www.in- 等等 限制性酶數(shù)據(jù)庫（限制性酶數(shù)據(jù)庫（restriction enzyme database，REBASE）。）。REBASE數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為：數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為：http:/ 該數(shù)據(jù)庫提供了限制性核酸內(nèi)切酶的各種信息，包括甲基化該數(shù)據(jù)庫提供了限制性核酸內(nèi)切酶的各種信息，包括甲基化酶、相應(yīng)的微生物來源、識(shí)別序列位點(diǎn)、裂解位點(diǎn)、甲基化特酶、相應(yīng)的微生物來源、識(shí)別序列位點(diǎn)、裂解位點(diǎn)、甲基化特異性、酶的商業(yè)來源以及參考文獻(xiàn)等，但該數(shù)據(jù)庫不提供酶切異性、酶的商業(yè)來源以及參考文獻(xiàn)等，但該數(shù)據(jù)庫不提供酶切圖譜。圖譜。 酶切結(jié)果

26、提供了限制性核酸內(nèi)切酶的名稱、內(nèi)切酶識(shí)別序列、酶切位點(diǎn)和同一內(nèi)切酶的酶切次數(shù)。 將所要分析的DNA序列輸入方框中再點(diǎn)擊“Get list of restriction enzymes”就可以得到下圖的結(jié)果。限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)分析示例限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)分析示例http:/insilico.ehu.es/restriction/one_seq/u 分析方法（舉例）分析方法（舉例）在本地計(jì)算機(jī)上利用在本地計(jì)算機(jī)上利用BioEdit工具進(jìn)行分析工具進(jìn)行分析打開要分析序列的文件并打開要分析序列的文件并copy序列，在序列，在BioEdit分析工具的分析工具的“File”欄欄目選擇目選擇“Ne

27、w from Clipboard”粘貼序列粘貼序列選擇被粘貼序列的名稱，在選擇被粘貼序列的名稱，在“Sequence”欄目點(diǎn)擊欄目點(diǎn)擊“Nucleic AcidRestriction Map”分析分析結(jié)果結(jié)果在在“Create Restriction Map”頁面中選擇限制性內(nèi)切酶種類、選頁面中選擇限制性內(nèi)切酶種類、選擇閱讀框等后點(diǎn)擊擇閱讀框等后點(diǎn)擊“Generate Map” 從原理來說，引物的設(shè)計(jì)和分析并不是從原理來說，引物的設(shè)計(jì)和分析并不是DNA序列分析序列分析的一個(gè)基本方法，但是在分子生物學(xué)研究中常常需要用的一個(gè)基本方法，但是在分子生物學(xué)研究中常常需要用到。主要介紹針對到。主要介紹針對

28、PCR的引物設(shè)計(jì)。的引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)u 確定確定PCR產(chǎn)物片段大小產(chǎn)物片段大小u 確定引物所在區(qū)段確定引物所在區(qū)段u 確定引物序列的長度范圍確定引物序列的長度范圍u 確定引物確定引物Tm（melting temperature）值范圍）值范圍人們總結(jié)出來的引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)有：人們總結(jié)出來的引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)有：引物的長度通常為引物的長度通常為20-30個(gè)堿基個(gè)堿基引物避免有發(fā)卡結(jié)構(gòu)引物避免有發(fā)卡結(jié)構(gòu)引物避免有彼此之間的互補(bǔ)配對引物避免有彼此之間的互補(bǔ)配對兩個(gè)引物之間避免有類似序列兩個(gè)引物之間避免有類似序列引物的特異性：引物的特異性：引物與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無引物與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他

29、序列無明顯類似明顯類似引物引物5端能加上合適的酶切位點(diǎn)端能加上合適的酶切位點(diǎn)。添加酶切位點(diǎn)是將。添加酶切位點(diǎn)是將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。引物組成均勻引物組成均勻，避免含有相同堿基的多聚體，兩個(gè)引，避免含有相同堿基的多聚體，兩個(gè)引物的物的GC含量近似含量近似引物引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失失敗。敗。 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) 可見，引物設(shè)計(jì)包含可見，引物設(shè)計(jì)包含序列組成的計(jì)算、序列對序列組成的計(jì)算、序列對DN

30、A序列數(shù)據(jù)庫的類似性檢索、兩個(gè)序列的比較、序列數(shù)據(jù)庫的類似性檢索、兩個(gè)序列的比較、堿基互補(bǔ)配對和發(fā)卡結(jié)構(gòu)分析以及酶切位點(diǎn)檢索堿基互補(bǔ)配對和發(fā)卡結(jié)構(gòu)分析以及酶切位點(diǎn)檢索等基等基本的本的DNA序列分析過程。事實(shí)上，許多序列分析過程。事實(shí)上，許多PCR引物設(shè)引物設(shè)計(jì)程序會(huì)略過或簡化上述的某些過程。計(jì)程序會(huì)略過或簡化上述的某些過程。Primer Premier 5.0下載下載http:/ 執(zhí)行安裝程序即可執(zhí)行安裝程序即可 *下載的為下載的為demo版，只能對它的示例序列進(jìn)行操作版，只能對它的示例序列進(jìn)行操作在在C盤下找到盤下找到WIN.INI，將，將vspace=DU改為改為vspace=PU便便可以

31、使用全部功能）可以使用全部功能） 功能功能可以簡單地通過手動(dòng)拖動(dòng)鼠標(biāo)以擴(kuò)增出相應(yīng)片段可以簡單地通過手動(dòng)拖動(dòng)鼠標(biāo)以擴(kuò)增出相應(yīng)片段所需的引物，而在手動(dòng)的任何時(shí)候，下面顯示各所需的引物，而在手動(dòng)的任何時(shí)候，下面顯示各種參數(shù)的改變和可能的二聚體、異二聚體、發(fā)夾種參數(shù)的改變和可能的二聚體、異二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。也可以給定條件，讓軟件自動(dòng)搜索引物，結(jié)構(gòu)等。也可以給定條件，讓軟件自動(dòng)搜索引物，并將引物分析結(jié)果顯示出來。而且進(jìn)行這些操作并將引物分析結(jié)果顯示出來。而且進(jìn)行這些操作非常簡單。非常簡單。Primer Premier 5.0其他引物設(shè)計(jì)軟件：其他引物設(shè)計(jì)軟件： 引物長度引物長度20-30個(gè)，最好不要超

32、過個(gè)，最好不要超過30個(gè)；個(gè)； Tm=（A+T）X 2+（G+C）X 4，退火溫度為，退火溫度為Tm-7 G+C%=40-60% 5、3 引物退火溫度最好相等；引物退火溫度最好相等； 最好不要出現(xiàn)四個(gè)及以上相同堿基相連的現(xiàn)象；最好不要出現(xiàn)四個(gè)及以上相同堿基相連的現(xiàn)象； 引物的最后一個(gè)避免為引物的最后一個(gè)避免為T。實(shí)際引物設(shè)計(jì)采用的幾條原則實(shí)際引物設(shè)計(jì)采用的幾條原則u 分析方法（舉例）分析方法（舉例）采用采用Primer3（/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）軟件進(jìn)行分析）軟件進(jìn)行分析在在Primer3的網(wǎng)頁粘貼序列，修改

33、參數(shù)的網(wǎng)頁粘貼序列，修改參數(shù)分析分析結(jié)果結(jié)果RNA二級結(jié)構(gòu)分析二級結(jié)構(gòu)分析 無論是無論是mRNA、rRNA還是還是tRNA，它們的功能最，它們的功能最終是由它們的折疊結(jié)構(gòu)來決定的終是由它們的折疊結(jié)構(gòu)來決定的，盡管這種折疊的，盡管這種折疊的結(jié)構(gòu)依賴于它的序列，但是它不僅僅由序列來確定。結(jié)構(gòu)依賴于它的序列，但是它不僅僅由序列來確定。研究研究RNA空間結(jié)構(gòu)對了解空間結(jié)構(gòu)對了解RNA功能、開展基因工程功能、開展基因工程和探索與和探索與RNA有關(guān)的生命現(xiàn)象等有著重要的意義。有關(guān)的生命現(xiàn)象等有著重要的意義。但是，但是，RNA分子降解快，其晶體難以獲得。分子降解快，其晶體難以獲得。當(dāng)前準(zhǔn)當(dāng)前準(zhǔn)確測定確測定R

34、NA折疊結(jié)構(gòu)還有賴于折疊結(jié)構(gòu)還有賴于X射線衍射技術(shù)，但射線衍射技術(shù)，但是是很難獲得很難獲得RNA分子晶體分子晶體，所以測定的結(jié)構(gòu)非常少。，所以測定的結(jié)構(gòu)非常少。因此，人們希望能因此，人們希望能通過通過RNA的序列來預(yù)測其結(jié)構(gòu)的序列來預(yù)測其結(jié)構(gòu)，首先是二級結(jié)構(gòu)。首先是二級結(jié)構(gòu)。 RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法 1960年，F(xiàn)resco等提出了第一個(gè)RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，論述了RNA二級結(jié)構(gòu)基本特征和預(yù)測原理。此后，各種RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法不斷涌現(xiàn)。 4種典型的預(yù)測方法 Nussinov的堿基最大配對方法的堿基最大配對方法 改法的原理是通過求出改法的原理是通過求出RNA分子中的最大氫鍵數(shù)，以預(yù)測具有最

35、大堿基配對的分子中的最大氫鍵數(shù)，以預(yù)測具有最大堿基配對的RNA二級二級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 Zuker極小自由能法極小自由能法 這是所有這是所有RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法中影響二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法中影響最大的一種算法，目前開發(fā)的序列分析軟件包中有許多基于最大的一種算法，目前開發(fā)的序列分析軟件包中有許多基于該算法的預(yù)測模塊，如該算法的預(yù)測模塊，如GCG中的中的FOLD模塊、模塊、PCGENE中的中的RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測模塊、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測模塊、PCFOLD系統(tǒng)等。該算法主要分兩系統(tǒng)等。該算法主要分兩步：第一步計(jì)算所有子序列的最低自由能并填充相應(yīng)矩陣，步：第一步計(jì)算所有子序列的最低自由能并填充相應(yīng)矩陣，第二步根據(jù)矩陣

36、，采用遞歸方法找出序列的二級結(jié)構(gòu)。第二步根據(jù)矩陣，采用遞歸方法找出序列的二級結(jié)構(gòu)。 螺旋區(qū)組合類方法螺旋區(qū)組合類方法 該法用于該法用于RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)預(yù)測時(shí)，首先給出螺旋區(qū)列表，然后根據(jù)此結(jié)果對螺時(shí)，首先給出螺旋區(qū)列表，然后根據(jù)此結(jié)果對螺旋區(qū)進(jìn)行堆積。旋區(qū)進(jìn)行堆積。 基于多重序列比對的基于多重序列比對的RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 該方法該方法的原理基于來自不同生物的同源的原理基于來自不同生物的同源RNA分子具有相分子具有相似的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，這種信息對構(gòu)建某一似的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，這種信息對構(gòu)建某一類生物的類生物的RNA二級結(jié)構(gòu)模式具有重要意義。二級結(jié)構(gòu)模式具有重要意義。

37、RNA分子通過分子內(nèi)的堿基配對而折疊，堿基對的分子通過分子內(nèi)的堿基配對而折疊，堿基對的氫鍵以及它們形成的局部螺旋的堆積力起著穩(wěn)定的作氫鍵以及它們形成的局部螺旋的堆積力起著穩(wěn)定的作用，即降低折疊結(jié)構(gòu)的自由能。用，即降低折疊結(jié)構(gòu)的自由能。RNA中能形成的堿基中能形成的堿基對包括對包括GC，AU、GU，他們分別有，他們分別有3個(gè)，個(gè)，2個(gè)，個(gè)，和一個(gè)氫鍵。分子的螺旋區(qū)形成莖（和一個(gè)氫鍵。分子的螺旋區(qū)形成莖（stem），那些不），那些不構(gòu)成互補(bǔ)配對的單鏈堿基形成環(huán)（構(gòu)成互補(bǔ)配對的單鏈堿基形成環(huán)（loop）。因此，預(yù)）。因此，預(yù)測測RNA二級結(jié)構(gòu)的一個(gè)很自然的方法是二級結(jié)構(gòu)的一個(gè)很自然的方法是尋找最大數(shù)

38、目尋找最大數(shù)目的堿基配對和計(jì)算的堿基配對和計(jì)算RNA分子的最低自由能分子的最低自由能。 RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析軟件二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析軟件 /applications/mfold/ MFOLD ：這是一個(gè)私人建立的網(wǎng)站，有多個(gè)版本，含有眾多RNA結(jié)構(gòu)站點(diǎn)的超鏈接，內(nèi)容主要集中在RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測理論和軟件上，如RNAstructure工具軟件，也可以將序列提交給MFOLD服務(wù)器來完成。Rnastructure最新下載最新下載/rnastructure.html*下載后直接安裝即可下載后直接安裝即可Rnastructure RNA Sturcture 根據(jù)最小自由能原理，將根據(jù)最小自由能原理，將Zuker的根據(jù)的根據(jù)RNA一級序列預(yù)測一級序列預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)的算法在軟件上實(shí)現(xiàn)。預(yù)測所用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)的算法在軟件上實(shí)現(xiàn)。預(yù)測所用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)是最近由是最近由Turner實(shí)驗(yàn)室獲得。提供了一些模塊實(shí)驗(yàn)室獲得。提供了一些模塊以擴(kuò)展以擴(kuò)展Zuker算法的能力，使之為一個(gè)界面友算法的能力，使之為一個(gè)界面友好的好的RNA折疊程