1、大腸桿菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)蛋白-蛋白復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)Alan Peterkofsky1*, Guangshun Wang2,Daniel S. Garrett2, Byeong Ryong Lee1,Yeong-Jae Seok3, and G. Marius Clore2*摘要大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸：葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）包括一系列負(fù)責(zé)在轉(zhuǎn)移過程中從磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）向葡萄糖轉(zhuǎn)移磷酸基團的蛋白質(zhì)。磷酸載體蛋白之間以及與調(diào)節(jié)目標(biāo)之間相互作用的機制適合用核磁共振光譜的方法研究。闡明了酶I的氮末端結(jié)構(gòu)域和HPr之間以及HPr和酶IIAGlc之間的復(fù)合體的三維解的結(jié)構(gòu)。HPr和酶I、

2、IIAGlc和糖原磷酸化酶的結(jié)合界面的分析揭示出在這些相互作用中包含了一個在HPr上的共同表面。同樣，在IIAGlc上的共同表面同HPr、IIBGlc和甘油激酶相互作用的表面。因此，一定存在一個為了蛋白蛋白相互作用并具有PTS特性的共同的基序。簡介一些組成性的和可誘導(dǎo)的大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由于在細(xì)胞膜存在特別的葡萄糖識別蛋白（通透酶）并且能影響同葡萄糖磷酸化相耦連的葡萄糖轉(zhuǎn)移的過程而被定義(Postma et al., 1996)。磷酸基團的來源是細(xì)胞內(nèi)的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。從能量的角度來看，PEP直接磷酸化通透酶的胞質(zhì)組分是可能的。然而，這個過程是非常復(fù)雜的；有許多的胞質(zhì)蛋白介導(dǎo)了

3、從PEP到通透酶的磷酸轉(zhuǎn)移（酶II）。酶I（EI）直接被PEP自身磷酸化，P酶I影響了通過磷酸載體蛋白HPr轉(zhuǎn)移到酶II的磷酸轉(zhuǎn)移。這個系統(tǒng)（PEP：葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，PTS）的復(fù)雜性很明顯是由于PTS的多功能能力，除了催化糖基轉(zhuǎn)移（見圖.1）之外，它還調(diào)控其他的系統(tǒng)。因此，酶I可能通過磷酸化乙酰激酶來調(diào)控三羧酸循環(huán)(Fox et al., 1986)。有人認(rèn)為HPr調(diào)控著糖原磷酸化酶的活性(Seok et al., 1997)。酶IHPr配合似乎在向化性的調(diào)控方面發(fā)揮著作用（Lux et al., 1995）。葡萄糖專一的酶II（IIAGlc）具有多種調(diào)節(jié)的相互作用。利用磷酸化的程度，它

4、影響了腺苷酸環(huán)化酶、甘油激酶和非PTS通透酶的活性（Postma et al., 1996）。對于包含在通過PTS進(jìn)行磷酸轉(zhuǎn)移的過程以及PTS蛋白參與調(diào)控過程的機制的理解在很大程度上是通過蛋白組分的相互作用的種類的三維結(jié)構(gòu)的可視化來實現(xiàn)的。人們已經(jīng)利用X衍射晶體學(xué)和NMR對PTS的單個的蛋白（酶I、HPr、IIA）進(jìn)行了廣泛的特征分析。然而，除了甘油激酶IIAGlc復(fù)合體(Feese et al., 1994)，沒有一個PTS蛋白和其他組分或者和調(diào)控配伍的復(fù)合體被成功的結(jié)晶。核磁共振（NMR）光譜學(xué)已經(jīng)成功地被人們用于解決蛋白蛋白復(fù)合體的結(jié)晶中遇到的問題。酶I和HPr之間以及HPr和IIAGl

5、c之間的氨基末端結(jié)構(gòu)域的三維解已經(jīng)成功地得到。這些PTS蛋白復(fù)合體的特性將在這里描述。酶IHPr復(fù)合體PTS的第一步包括由酶I的PEP產(chǎn)生的自身磷酸化。PEP的結(jié)合位點被定位在一個具有二個結(jié)構(gòu)域的C端結(jié)構(gòu)域中，而磷酸化的活性位點（His189）在N端結(jié)構(gòu)域中（LiCalsi et al., 1991），磷酸化的酶I轉(zhuǎn)移它的磷酸基團到HPr的活性位點His15。當(dāng)含氨基末端的一半的酶I（EIN）可以被PEP自身磷酸化的時候，這個蛋白結(jié)構(gòu)域保持反向轉(zhuǎn)移一個磷酸基團到HPr的能力，表明同HPr殘基的結(jié)合位點在EIN（Seok et al., 1996）。想要降低完整EIN晶體的結(jié)構(gòu)一直都沒有成功，但

6、是EIN的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被X晶體衍射(Liao et al., 1996)和NMR (Garrett et al., 1997a)解析了。EI或者EIN和HPr的混合物已經(jīng)被用于共結(jié)晶試驗，但沒有成功。EINHPr復(fù)合體（40k Da）是到目前為止被NMR解析的最大的結(jié)構(gòu)之一（Garrett et al., 1999）。這個結(jié)構(gòu)測定采用了為了指定的目的以及為了特異地觀察EIN和HPr之間的分子間核Overhauser增強（NOE）接觸而利用的多種同位素標(biāo)記（15N, 13C 和/或 2H）的蛋白質(zhì)的組合去簡化光譜的多維異核NMR光譜技術(shù)。此外，殘基兩極耦連技術(shù)也被用來提供對于決定復(fù)合體中兩個蛋白的方

7、向極為有用的長程定向信息。在圖.2 中顯示了兩幅闡釋整個復(fù)合體的絲帶圖。EIN包含兩個亞結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域（33-143殘基）顯示為紅色，是一個由H1、H2/H2'、H3和H4四個螺旋組成的四螺旋束；/結(jié)構(gòu)域（1-20和148-230殘基），顯示為藍(lán)色，由四股平行的片層(1-4)組成的一個b三明治和一個三股反向平行的片層(1, 5, 6)組成；此外，還有一個長的C端螺旋（H8）作為同EI的C端結(jié)構(gòu)域的連接。HPr包含三個螺旋和一個四股反向平行的片層。復(fù)合體中EIN和HPr的結(jié)構(gòu)同在自由狀態(tài)的非常相似。EIN同HPr的相互作用僅僅包括了EIN的亞結(jié)構(gòu)域，這同前面的化學(xué)位移擾動作圖是一致的（G

8、arrett et al., 1997b）。圖. 3顯示的是這兩個蛋白的接觸的更為詳細(xì)的匯總。在界面的地方一共有44個殘基，其中21個來自EIN，另外23個來自HPr。這兩個蛋白大部分的接觸點都是疏水的。含有三個或更多分子間接觸點的疏水殘基是：EIN的Ala71、Ile72、Met78、Leu79、Leu115、Try122、Leu123、Arg126以及HPr的Thr16、Arg17、Ala20、Leu47、Phe48和Thr52。此外，還有11個分子間靜電相互作用，包括兩個側(cè)鏈到骨架的氫鍵和六個鹽橋。EIN的Tyr122的羥基和Arg126的胍基有氫鍵連接到了HPr的Leu14的骨架的羰基

9、上。鹽橋則分別包括EIN和HPr殘基的如下配對：Glu67 和 Arg17, Glu68 和 Arg17, Glu74 和 Lys24, Asp82 和 Lys27, Glu84 和 Lys45 ，以及 Glu84 和 Lys49。此外，Asp82的羧基不僅僅參與分子間鹽橋，同時，它也接受來自Glu84和Leu85的骨架氨基上的兩個氫鍵，這有助于穩(wěn)定EIN的2和2' 之間的螺旋。最后，再Asp129和Thr16，Glu84 和 Ser46 以及 Arg126 和 Gln51 之間還有三個側(cè)鏈側(cè)鏈氫鍵相互作用。EIN和HPr之間狀態(tài)轉(zhuǎn)變的重要方面在圖. 4中給出了。EIN和HPr分別在H

10、is189的N2原子和His15的N1原子被磷酸化。在復(fù)合體沒有被磷酸化的形式里，His189不同HPr接觸，它的N2原子接受來自Thr168的羥基的質(zhì)子的氫鍵，就好像它在自由EIN做的那樣，這樣它就被導(dǎo)向了遠(yuǎn)離His15的N1原子。轉(zhuǎn)換狀態(tài)的建模是通過增加一個磷酸基團（利用合適的三角雙錐幾何學(xué)）到EIN的His189和HPr的His15之間的配對中點，去掉分子內(nèi)在His189的側(cè)鏈和Thr168的甲基之間的NOE，以及在剩余實驗的NMR限制的基礎(chǔ)上對模擬退火計算進(jìn)行重復(fù)完成的。這產(chǎn)生了圖. 4 中所示的結(jié)構(gòu)，在那里，唯一顯著的改變包含His189的側(cè)鏈2角翻轉(zhuǎn)150°，允許了His

11、189的原子非常靠近His15的N1原子。轉(zhuǎn)移狀態(tài)的五配位磷定位在由EIN的2螺旋尾部的N末端和HPr的1螺旋尾部的N末端形成的裂隙的底部。從結(jié)構(gòu)上來講，轉(zhuǎn)移狀態(tài)更傾向于在HPr磷酸化時穩(wěn)定，而不是在EIN磷酸化時。此外，EIN磷酸化使得EIN去穩(wěn)定化，部分是由于缺失了在His189和Thr168之間的氫鍵，這個氫鍵更傾向于磷酸從EIN轉(zhuǎn)移到HPr。這兩個因素導(dǎo)致了激發(fā)PTS中的磷酸轉(zhuǎn)移朝著合適的方向發(fā)生。HPrIIAGlc復(fù)合體磷酸化的HPr是一個所有PTS酶II的磷酸通用供體。這個磷酸轉(zhuǎn)移活性伴隨著從PTS系列的通用磷酸轉(zhuǎn)移部分到葡萄糖特異的那條途徑。特別有意思的是葡萄糖特異的載體（IIA

12、Glc）。這個蛋白不僅僅作為葡萄糖轉(zhuǎn)移過程中的中間體，同時也作為非PTS通透酶和腺苷酸環(huán)化酶的調(diào)節(jié)者（圖. 1）。E. coli 的HPr和IIAGlc的三維結(jié)構(gòu)都已經(jīng)被X晶體衍射和NMR解析了（Herzberg and Klevit, 1994）。由NMR進(jìn)行的E. coli 的HPrIIAGlc的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析已經(jīng)有人在做并圓滿地完成了（Wang et al.,2000a）。至于前面討論過的EINHPr的結(jié)構(gòu)，HPrIIAGlc復(fù)合體的結(jié)構(gòu)是采用同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)的組合，利用多維異核NMR光譜技術(shù)解析的。在HPr、IIAGlc復(fù)合體的問題上，結(jié)構(gòu)計算利用了一個新穎的程序，這個程序利用剛體最

13、小的原理去錨定這個結(jié)構(gòu)，緊接著，利用強制/限制模擬退火去精確確定界面的側(cè)鏈位置（Clore, 2000）。這是可能實現(xiàn)的，因為當(dāng)結(jié)果的復(fù)雜信息出現(xiàn)時，并沒有顯著的骨架構(gòu)象的變化發(fā)生。圖. 5 中顯示了HPrIIAGlc復(fù)合體的絲帶圖。正如前面確定的，HPr是作為一個正面開放的/三明治蛋白，它的三個螺旋正好在四股反向平行的片層的正上方。IIAGlc結(jié)構(gòu)主要是由每一側(cè)都有六股反向平行鏈的三明治樣結(jié)構(gòu)的片層組成。內(nèi)部蛋白結(jié)合面包括HPr上凸起的區(qū)域（螺旋1和2）以及IIAGlc上凹進(jìn)去的區(qū)域的互補的結(jié)合（鏈5、6、7、和10）。在接觸面的41個殘基包括來自HPr的18個和來自IIAGlc的23個。（

14、圖 略）圖1 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）與跟它相互作用的組分。（圖略）圖2 EIN-HPr復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。絲帶圖表示出復(fù)合體的兩個視角。HPr，綠色；EIN的結(jié)構(gòu)域，紅色；/結(jié)構(gòu)域和C末端，金黃色。(出自 Garrett et al., 1999)（圖略）圖3 EIN-HPr相互作用。EIN和HPr之間的靜電（頂部）和范德華力（底部）的相互作用。紅色線條表示HPr的螺旋1和EIN的螺旋4之間的相互作用，綠線表示HPr的螺旋1和2與EIN的螺旋2和2´之間的相互作用，藍(lán)線表示HPr的螺旋2和EIN的螺旋3和4之間的相互作用。虛線表示靜電相互作用，顯示了側(cè)鏈骨架的氫鍵（出自Garrett e

15、t al., 1999）圖4 EIN-HPr復(fù)合體的轉(zhuǎn)換狀態(tài)。沒有被磷酸化的復(fù)合體的EIN的螺旋5和6以及HPr的螺旋1在轉(zhuǎn)換狀態(tài)是層次分明的。EIN的His189和HPr的His15的構(gòu)象改變以及后來EIN的螺旋5和6的被替換顯示在圖中（出自Garrett et al., 1999）。（圖略）圖5 HPr-IIAGlc復(fù)合體的絲帶圖。顯示了兩幅圖；HPr，綠色；IIAGlc，藍(lán)色。顯示了活性位點組氨酸（HPr的His15和IIAGlc的His90）的定位，以及在界面附近的二級結(jié)構(gòu)元件（Wang et al., 2000a）。（圖略）圖6 配伍蛋白之間的相互作用。（A）HPr和它的配伍蛋白EI

16、N和IIAGlc（表示為IIA）之間的相互作用；（B）IIAGlc和它的配伍HPr和甘油激酶（表示為GK）之間的相互作用。疏水相互作用，藍(lán)色；靜電相互作用，紅色（出自Wang et al., 2000a）。（圖略）圖7 闡明包含在（A和B）EIN-HPr，（C和D）HPr-IIAGlc以及（E和F）IIAGlc-GK復(fù)合體中的結(jié)合表面的空間表示。EIN和IIAGlc上的HPr結(jié)合表面分別顯示在（A）和（C）；GK在IIAGlc上的結(jié)合表面分別顯示在（B）和（D）；IIAGlc在GK上的結(jié)合表面顯示在（F）。結(jié)合表面采用顏色編號，疏水殘基為綠色，極性殘基為亮藍(lán)色，活性組氨酸為紫色，帶正電殘基位深

17、藍(lán)色帶負(fù)電殘基為紅色。配伍蛋白骨架的相關(guān)部分顯示為金色絲帶，帶正電的側(cè)鏈顯示為深藍(lán)色，而帶負(fù)電的為紅色。只有帶電的殘基和活性位點的組氨酸被標(biāo)記了，這些從HPr和GK的殘基顯示為意大利文。注意到盡管EIN的活性位點的組氨酸（His189）以及IIAGlc活性位點的組氨酸（His90）與HPr的His15緊密接觸，他們到達(dá)的方位并不一樣。His189（EIN）從上面接近His15（B），而His90（IIAGlc）從下面接近His15（D）（出自Wang et al., 2000a） （圖略）圖8 HPr 側(cè)鏈可塑性。（A）HPr-IIAGlc和EIN-HPr復(fù)合體的界面的選擇區(qū)域的重疊的立體圖，

18、表明了HPr的Phe48的不同的構(gòu)象；（B）顯示HPr的Arg17的不同構(gòu)象的兩個復(fù)合體的區(qū)域的重疊。HPr-IIAGlc復(fù)合體中的HPr，紅色；EIN-HPr復(fù)合體中的HPr，藍(lán)色；EIN，紫色；IIAGlc，綠色（出自Wang et al., 2000a）（圖略）圖9 HPr上配伍蛋白的結(jié)合表面。（a）糖原磷酸化酶（GP）的結(jié)合表面；（b）IIAGlc的結(jié)合表面；（c）EIN的結(jié)合表面。骨架化學(xué)位移擾動被畫到了HPr的一幅絲帶圖上（圖的左邊）和HPr的可達(dá)表面上（圖的右邊）。位移的尺度用從藍(lán)色（沒有位移）經(jīng)過黃色（中度位移）一直到紅色（最大位移）的漸變來表示。二級結(jié)構(gòu)元件在（a）中用絲帶圖

19、標(biāo)記出來了。HPr的組氨酸在絲帶圖上用紅色表示（出自Wang et al., 2000a）。 HPr和IIAGlc之間的接觸示于圖. 6。每一個結(jié)合表面的中央部位是絕對疏水的，在HPr方面，由Thr16、Ala20、Val23 和 Leu47的甲基和Phe48的芳香環(huán)組成，在IIAGlc方面由41、71和88位的三個苯丙氨酸組成的環(huán)，間雜著三個在40、46和96位上的纈氨酸組成。中央疏水區(qū)在兩者中都是被極性的和帶電的殘基包圍。后者在HPr中全部帶正電而在IIAGlc中則全部帶負(fù)電。只要從復(fù)合體的配位開始，而且在兩個活性的組氨酸之間合適的雙錐幾何半程引進(jìn)磷酸基團，接下來再實驗NOE和雙極耦聯(lián)限制

20、的基礎(chǔ)上利用剛體最小化和強制/限制模擬退火的方法，成功模擬HPr和IIAGlc之間的轉(zhuǎn)變狀態(tài)是可能的。在組合模型中，HPr的His15以及IIAGlc的His90的咪唑環(huán)平面相互大致呈90°。在復(fù)合體中，His15的咪唑環(huán)的方位和HPr的Arg17的側(cè)鏈?zhǔn)怯梢恍┦杷挽o電接觸來保持穩(wěn)定的。在HPr方面（圖. 6A）,我們對一個先前對于HPrEIN是正確的接觸點作了一個比較。同樣的，在IIAGlc方面（圖. 6B），這個比較則是與甘油激酶（GK）的界面的。HPr上同EIN和IIAGlc的結(jié)合界面非常的相似，在總共18個與IIAGlc以及23個與EIN相接觸的殘基中，共享17個相同的殘基

21、（圖. 6A）。這種普遍的凸起的結(jié)合表面是由極性的和帶正電的殘基組成的一個環(huán)所包圍的中央疏水區(qū)。在EIN和IIAGlc上用于HPr綁定面的骨架腳手架則完全不同。在EIN上的HPr綁定面由a螺旋組成而在IIAGlc上則主要是b片層。然而，兩個綁定面的表面的代表表明它們在外形和殘基分布上都相似（見圖. 7）。EIN和IIAGlc的綁定面是凹的而且呈環(huán)形，它的疏水的核心被一個由極性的和帶負(fù)電并與在HPr上帶正電的綁定表面互補的環(huán)所包圍。為了同時成功地獲得EIN和IIAGlc的復(fù)合體，要求HPr側(cè)鏈殘基的可塑性，如圖圖. 8。Phe48參與了一些重要的疏水接觸。在EINHPr復(fù)合體中，Phe48的扭轉(zhuǎn)

22、角處于允許它與EIN的Leu79、Leu85、Ile108和Gln111相互作用的構(gòu)象中（圖. 8A）。然而，在HPrIIAGlc復(fù)合體中，Phe48的側(cè)鏈則處于不同的構(gòu)象，允許它同IIAGlc的b6 和 7的骨架相互作用的構(gòu)象。因此，Phe48根據(jù)它相互作用的對象不同采用了特異的構(gòu)象。HPr的Arg17的可塑性示于圖. 8B。在EINHPr復(fù)合體中，側(cè)鏈處于可以同EIN的Glu67和68位的羧基形成離子對的構(gòu)象中。在HPrIIAGlc復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)了Arg17側(cè)鏈的一種不同的構(gòu)象，使得它可以同IIAGlc的Asp38和94位的羧基形成離子對。至于包括HPr的多復(fù)合體，IIAGlc同多個配伍形成

23、的復(fù)合體表明存在交錯（圖. 6B）。與HPr交互作用的IIAGlc上的表面有23個殘基，其中16個同樣也與甘油激酶（GK）存在交互。組成HPr和GK上面IIAGlc綁定表面的腳手架同樣也不同。當(dāng)HPr上的綁定表面包含兩個螺旋的時候，在GK上有一個短的螺旋和三個環(huán)的部分。展現(xiàn)給HPr和GK的IIAGlc的綁定表面都是凹的。而且，包含在兩個綁定表面的IIAGlc上的疏水殘基的定位幾乎都是一樣的；對于極性和帶正電的殘基來說也是這樣的。已經(jīng)闡明的蛋白蛋白相互作用表明對于同EI和IIAGlc相互作用，在HPr的綁定表面上存在廣泛的交錯（圖. 6B）。這與HPr和IIAGlc的活性位點區(qū)域為了達(dá)到恰當(dāng)?shù)牧姿徂D(zhuǎn)移以及調(diào)控機制的目的而必須同它們交互作用的配伍相接觸是一致的。HPr上與配伍蛋白交互作用的共同的界面在前面的討論中，HPr上錨定到EI或者IIAGlc的區(qū)域是相似的這個觀點越來越明顯了。而且，IIAGlc上錨定到HPr的表面同它與GK交