1、第 十四 章 色譜 法分 離原 理一教 學(xué)內(nèi) 容1. 色 譜 分 離 的 基 本 原理和基 本 概 念2. 色 譜 分 離 的 理 論 基礎(chǔ)3. 色 譜 定 性 和 定 量 分析的方 法二重 點(diǎn)與 難 點(diǎn)1. 塔 板 理 論 ， 包 括 流 出 曲 線 方 程 、 理 論 塔 板 數(shù) n 及 有 效 理 論 塔 板 數(shù)neff和塔板高度H及有效塔板高度Heff的計算2. 速 率 理 論 方 程3. 分 離 度 和 基 本 分 離 方 程三教學(xué)要求1. 熟 練 掌 握 色 譜 分 離方法的 原 理2. 掌 握 色 譜 流 出 曲 線色譜 峰 所 代 表的各種 技術(shù)參數(shù)的準(zhǔn) 確 含義3. 能 夠

2、利 用 塔 板 理 論和速率 理 論 方 程 判 斷影響 色譜分離各種 實 驗因 素4. 學(xué) 會 各 種 定 性 和 定量的分 析 方 法四 學(xué)時安排 4 學(xué)時第一 節(jié) 概述色譜法早在1903年由俄國植物學(xué) 家茨 維特 別離植物色素時采 用 。他 在 研 究 植 物 葉 的 色 素 成 分 時 ，將 植 物 葉 子 的 萃 取 物 倒 入 填 有 碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后參加石油醚使其自由流下，結(jié)果色素 中各組分互相別離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為 色譜法。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的別離，“色譜二字雖已 失去原來的含義但仍被人們沿用至今。在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜

3、止不動的一相固 體或液體稱為固定相；自上而下運(yùn)動的一相一般是氣體或液 體稱為流動相；裝有固定相的管子玻璃管或不銹鋼管稱為 色譜柱 。當(dāng)流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā) 生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的 類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固 定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。從不同角度，可將色譜法分類如下：1. 按兩相狀態(tài)分類氣體為流動相的色譜稱為氣相色譜GC根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液附著在惰性載體上的 一薄層有機(jī)化合物液體，又可分為氣固色譜GSC和氣液色譜GLC。液體為流動相的色譜稱液相色譜LC同理液相

4、色譜亦可分為液固色譜LSC和液液色譜LLC。 超臨界流體為流動相的色譜為超臨界流體色譜SFC。隨著色譜 工作的開展，通過化學(xué)反響將固定液鍵合到載體外表，這種化學(xué)鍵 合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜CBPC.2. 按別離機(jī)理分類利用組分在吸附劑固定相上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分 離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液固定相中溶解度不同而到達(dá)別離的方法 稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑固定相上的親和力大小不同而到達(dá) 別離的方法，稱為離子交換色譜法利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而到達(dá)別離 的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。最近，又有一種新別離技術(shù)，利用不同組分與固定相固定化

5、 分子的 高專屬性親和力進(jìn)行別離的技術(shù)稱為親和色譜法，常 用于 蛋白質(zhì)的別離。3. 按 固 定 相 的 外 型 分 類 固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。 固定相呈平板狀的色譜，稱 為平板色譜，它 又可分為薄層色譜 和紙色譜。4. 按照展開 程序 分類 按照展開程序的不同，可將色譜法分為洗脫法、頂替法、和 迎頭法。洗脫法也稱沖洗法。工作 時，首先將樣品加到色譜柱頭上， 然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。 由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同.被沖洗劑帶出的先 后次序也不同，從而使組分彼此別離。這種方法能使樣品的各組分獲得良好的別離，色 譜峰清晰。此 外，除去沖洗劑

6、后，可獲得純度較高的物質(zhì)。目前，這種方法是色 譜法中最常用的一種方法。頂替法是將樣品加到色譜柱頭后 ，在惰性流動相中參加對固定 相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強(qiáng)的物質(zhì)為頂替劑 或直接用 頂替劑作流動相，通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強(qiáng) 弱順序，依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分 最先流出，最強(qiáng)的最后流出。此法適于制備純物質(zhì)或濃縮別離某一組分；其缺點(diǎn)是經(jīng)一次 使用后，柱 子就被樣品或頂替劑飽和，必須更換柱子或除去被柱子 吸附的物質(zhì)后，才能再使用。迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱，吸 附或溶解能力最弱 的組分首先一純物質(zhì)的狀態(tài)流出，其 次那么以第一組分和吸附或溶解 能力

7、較弱的第二組分混合物，以此類推。該法在別離多組分混合物 時，除第一組分外，其余均非純態(tài)，因此僅適用于從含有微量雜質(zhì) 的混合物中切割出一個高純組分組分A，而不適用于對混合物 進(jìn)行別離。第二節(jié) 色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語一色譜流出曲線和色譜峰由檢測器輸出的電信號強(qiáng)度對時間作圖，所得曲線稱為色譜 流出曲線。曲線上突起局部就是色譜峰。如果進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線氣固吸附色譜 或分配等溫線氣液分配色譜的線性范圍內(nèi)，那么色譜峰是對稱的。二基線在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲 線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。三峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示?；€a峰高h(yuǎn)四保

8、存值1. 死時間t 0不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰 極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流 動相流動速度相近。測定流動相平均線速口時，可用柱長L與t 0的比 值計算，即u = L/t o2. 保存時間t r試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時所經(jīng)過的時間，稱為保存時 間3. 調(diào)整保存時間t r '某組分的保存時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保存時 間，即t r ' = t r - t 0由于組分在色譜柱中的保存時間tr包含了組分隨流動相通過柱 子所須的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所

9、以tr實際上是 組分在固定相中保存的總時間。保存時間是色譜法定性的根本依據(jù)，但同一組分的保存時間常 受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保存體積來表示保 留值。4. 死體積V指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色 譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩相 很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速Feo (cm3 min-1)計算。Vo = t 0 Fe o式中Fe。為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于 氣相色譜，不適用于液相色譜。5. 保存體積Vr指從進(jìn)樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時所通過 的流動相的體積。保存時間與保存體

10、積關(guān)系：Vr = t r Feo6. 調(diào)整保存體積VL某組分的保存體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保存體 積。Vr = Vr - Vo = t rFeo7. 相對保存值r 2,1某組分2的調(diào)整保存值與組分1的調(diào)整保存值之比，稱為相對 保存值。r 2, 1= t r2 / t r 1 '二2/1由于相對保存值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱 長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在 氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。在定性分析中，通常固定一 個色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)(s)，然后再求其它峰(i )對這個峰的相對保 留值，此時可用符號表示，即:-=t r ( i) / t

11、r( S)式中tr (i)為后出峰的調(diào)整保存時間，所以：總是大于1的。 相對保存值往往可作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又稱選擇因子。(五) 區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡 量柱效率及反映色譜操作條件的動力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾?通常有三種方法。1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差;即0. 60 7倍峰高處色譜峰寬的一半。2. 半峰寬W/ 2即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為W/2=2. 354 二3. 峰底寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上截距間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn) 偏差二的關(guān)系是 W = 4匚 從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i )根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所

12、含組分的最少個數(shù)；(i i) 根據(jù)色譜峰的保存值，可以進(jìn)行定性分析；(i ii )根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；(iv)色譜峰的保存值及其區(qū)域?qū)挾?，是評價色譜柱別離效能的依據(jù)；v 色譜峰兩峰間的 距離 ，是評價固定相或流動相選擇是否合 適的依據(jù)。色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此別離，組 分要到達(dá)完全 別離，兩 峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩 峰間的距離是由組分在兩相間 的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。第三節(jié) 色譜 法根本原理一 分配系數(shù)K和分配比k1. 分 配 系 數(shù) K分配色譜的別離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反 復(fù)屢次的分配過程，而吸附色譜的別離是基于反復(fù)屢次

13、的吸附-脫 附過程。這 種別離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而 描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)Ko它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分 配達(dá)平衡時的濃度之比值，即K= 溶 質(zhì) 在 固 定 相 中 的 濃 度 / 溶 質(zhì) 在 流 動 相 中 的 濃 度 =Cs / Cm分配系數(shù)是由組分和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的，它是每一 個溶質(zhì)的特征值，它僅與兩個變量有關(guān)：固定相和溫度。與兩相體 積、柱管的特性以及所使用的儀器無關(guān)。2. 分 配 比 k分配比又稱容量因子，它 是指在一定溫度和壓力下，組 分在 兩相間分配達(dá)平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。即 k = 組分在固定相中

14、的質(zhì)量 / 組分在流動相中的質(zhì)量 =ms / mmk值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大， 因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被別離組分保存 能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅 隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關(guān)。k = ms / mm = Cs Vs / CmVm式中Cs, Cm分別為組分在固定相和流動相的濃度；Vm為柱中流動 相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同 的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中， 那么表示固定相的孔體積。分配比k值可直接從色

15、譜圖中測得(推導(dǎo)過程教材 P. 296 297)。k = (t r - t 0 ) / t 0 = t r / t 0= V r / V 04. 分配系數(shù)K與分配比k的關(guān)系K = k .-其中B稱為相比率，它是反映各種色譜柱柱型特點(diǎn)的又一個參 數(shù)。例如，對填充柱，其B值一般為635 ;對毛細(xì)管柱，其B值為 60600。4. 分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子a的關(guān)系對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：a = t r ( B) / t r (A)= k ( A)/ k ( B) =K ( A)/K ( B)通過選擇因子a把實驗測量值k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K直 接聯(lián)系起來，a對固定相的選擇具有實際

16、意義。如果兩組分的K或 k 值相等，那么a =1，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組 分的K或 k值相差越大，那么別離得越好。因此兩組分具有不同的分配 系數(shù)是色譜別離的先決條件。圖中Ka>Kb ,因此，A組分在移動過程中滯后。隨著兩組分在色 譜柱中移動距離的增加，兩峰間的距離逐漸變大，同時，每一組分 的濃度輪廓即區(qū)域?qū)挾纫猜儗?。顯然，區(qū)域擴(kuò)寬對別離是 不利的，但又是不可防止的。假設(shè)要使A、B組分完全別離，必須滿足 以下三點(diǎn)：第一，兩組分的分配系數(shù)必須有差異；第二，區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于區(qū)域別離的速度；第三，在保證快速別離的前提下，提供足夠長的色譜柱。第一、二點(diǎn)是完全別離的必要條

17、件。作為一個色譜理論，它 不僅應(yīng)說明組分在色譜柱中移動的速率，而且應(yīng)說明組分在移動過 程中引起區(qū)域擴(kuò)寬的各種因素。塔板理論和速率理論均以色譜過程 中分配系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色譜理論。二塔板理論把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述 組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的 指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊 塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。塔板理論假設(shè)：1. 在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速到達(dá)平 衡。這 一小段柱長稱為理論塔板高度H。2. 以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動 式，每次進(jìn)氣為

18、一個塔板體積 Vm。3. 所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸(縱)向擴(kuò) 散可忽略。4. 分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。簡單地認(rèn)為：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快到達(dá)分配 平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根 長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：n稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔 板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。塔板理論指出：第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50 時，可得到根本對稱的峰形曲線。在色譜柱中，n值一般很大，如 氣相色譜柱的n約為103 10 6，因而這時的流出曲線可趨近于正態(tài) 分

19、布曲線。第二，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配 系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復(fù)屢次的分配平衡后，仍可獲得良好的分 離。第三，n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為：2 2n = 5.5 4(t r / W/2)= 16 (t r / W)式中t r與W/2( W )應(yīng)采用同一單位(時間或距離)。從公式可以看出，在t r 一定時，如果色譜峰很窄，那么說明n越大，H越小， 柱效能越高。在實際工作中，由公式n = L/Hn = 5.5 4(t r / W/2)16 ( t r / W)計算出來的的n和H值有時并不能充分地反映色譜柱的別離效能，因為采用tR計算時，沒有扣除死時間tM， 所以常用有效塔板數(shù)n

20、有效表示柱效：2 2n有效=5. 54 (t r / W/2)= 16 ( t / / W)L / n有效有效板高因為在相同的色譜條件下，對不同的物質(zhì)計算的塔板數(shù)不一 樣，因此，在說明柱效時，除注明色譜條件外，還應(yīng)指出用什么物 質(zhì)進(jìn)行測量。例 某組分峰的峰底寬為40 s，保存時間為40 0 s ，計算此 色譜柱的理論塔板數(shù)。2 2解： n =16 ( t r / W) =16( 40 0 / 40)= 16 00 塊塔板理論是一種半經(jīng)驗性理論。它用熱力學(xué)的觀點(diǎn)定量說明 了溶質(zhì)在色譜柱中移動的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了 計算和評價柱效上下的參數(shù)。但是，色譜過程不僅受熱力學(xué)因素的 影響，

21、而且還與分子的擴(kuò)散、傳質(zhì)等動力學(xué)因素有關(guān)，因此塔板理 論只能定性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響； 也不能說明為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)， 因而限制了它的應(yīng)用。(三)速率理論19 56年荷蘭學(xué)者van Dee mt er (范第姆特)等在研究氣液色譜 時，提出了色譜過程動力學(xué)理論速率理論。他們吸收了塔板理 論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程， 從而在動力學(xué)根底上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模 型對氣相、液相色譜都適用。va n Dee mt er方程的數(shù)學(xué)簡化式為H = A+B / u+C u式中u為流動相的線速度；A、B、C、

22、為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò) 散系數(shù)、分子擴(kuò)散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力項系數(shù)。第三節(jié)色譜法根本原理1. 渦流擴(kuò)散項A在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進(jìn) 中形成紊亂的類似渦流的流動，故稱渦流擴(kuò)散。由于 填充 物顆 粒大小的 不同 及填充物 的不 均勻 性，使組 分在色譜 柱中路徑長短不一，因而同時進(jìn)色譜柱的相同組分到達(dá)柱口時間并 不一致，引起了色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：A = 2 入 dp上式說明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)那么因子 入有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流 擴(kuò)散， 提高

23、柱效， 使用細(xì)而均勻的顆粒， 并且填充均勻是十分必要 的。 對于空心毛細(xì)管， 不存在渦流擴(kuò)散。 因此 A = 0。2. 分 子 擴(kuò) 散 項 B / u ( 縱 向 擴(kuò) 散 項 )縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。 組分從柱入口參加， 其濃 度分布的構(gòu)型呈“塞子狀。 它隨著流動相向前推進(jìn)， 由于存在濃 度梯度， “塞子必然自發(fā)的向前和向后擴(kuò)散， 造成譜帶展寬。 分 子擴(kuò)散項系數(shù)為 B = 2 丫 Dg丫是填充柱內(nèi)流動相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了 固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中擴(kuò)散系數(shù)(cm3 s-1),分子擴(kuò)散項與組 分在流動相中擴(kuò)散系數(shù)Dg成正

24、比Dg與流動相及組分性質(zhì)有關(guān)：(a) 相對分子質(zhì)量大的組分Dg小，Dg反比于流動相相對分子質(zhì)量的 平方根，所以采用相對分子質(zhì)量較大的流動相，可使B項降低；(b) Dg隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。另外縱向擴(kuò)散與組分在色譜柱內(nèi)停留時間有關(guān)， 流動相流速 小， 組分停留時間長， 縱向擴(kuò)散就大。 因 此為降低縱向擴(kuò)散影響， 要加大流動相速度。 對于液相色譜， 組分在流動相中 縱向擴(kuò)散可以 忽略。3. 傳 質(zhì) 阻 力 項 Cu由于氣相色譜以氣體為流動相， 液相色譜以液體為流動相，它們的傳質(zhì)過程不完全相同。(1)氣液色譜傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù) Cl兩項，即C = Cg

25、 + Ci氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動到固定相外表的過程。 這一過程中試樣組分將在兩相間進(jìn)行質(zhì)量交換，即進(jìn)行濃度分配。 有的分子還來不及進(jìn)入兩相界面， 就被氣相帶走；有的那么進(jìn)入兩相界面又來不及返回氣相。這樣使得 試樣在兩相界面上不能瞬間到達(dá)分配平衡，引 起滯后現(xiàn)象，從而使 色譜峰變寬。對于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg為：Cg= 0. 01 k2 / ( 1 + k)2 dp / Dg式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度 dp的平方成正比，與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)Dg成反比。因此， 采用粒度小的填充物和相對分子質(zhì)量小的氣體(如氫氣)做載氣， 可使Cg減小，提高柱效。液

26、相傳質(zhì)過程是指試樣組分從固定相的氣/液界面移動到液 相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，到達(dá)分配平衡，然后又返回氣/液界面 的傳質(zhì)過程。這個過程也需要一定的時間，此時，氣相中組分的其 它分子仍隨載氣不斷向柱口運(yùn)動，于是造成峰形擴(kuò)張。液相傳質(zhì)阻 力系數(shù)Ci為：Ci = 2/3* k / ( 1 + k ) 2 df2 / D1由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴(kuò)散系數(shù) D1大，那么液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚 度，但k值隨之變小，又會使C增大。當(dāng)固定液含量一定時，液膜厚 度隨載體的比外表積增加而降低，因此，一般采用比外表積較大的 載體來降低液膜厚度。但比外表太大，由于吸附

27、造成拖尾峰，也不 利于別離。雖然提高柱溫可增大D1，但會使k值減小，為了保持適當(dāng)?shù)腃i值，應(yīng)控制適宜的柱溫。2液液分配色譜傳質(zhì)阻力系數(shù)C包含流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs，即Cm +Cs其中Cm又包含流動的流動相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動相中的Dm + s md傳質(zhì)阻力，即：Dm式中右邊第一項為流動的流動相中的傳質(zhì)阻力。當(dāng)流動相流過 色譜柱內(nèi)的填充物時，靠近填充物顆粒的流動相流速比在流路中間 的稍慢一些，故柱內(nèi)流動相的流速是不均勻的。這種傳質(zhì)阻力對板高的影響與固定相粒度dp的平方成正比， 與試樣分子在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比，CD m是由柱和填充的性 質(zhì)決定的因子。右邊第二項

28、為滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力。這是由于固定相的多孔性，會造成某局部流動相滯留在一個局部，滯留 在固定相微孔內(nèi)的流動相一般是停滯不動的流動相中的試樣分子 要與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換，必須首先擴(kuò)散到滯留區(qū)。如果固定相的 微孔既小又深，傳質(zhì)速率就慢，對峰的擴(kuò)展影響就大如教材P. 30 2 圖15.6所示。式中D m是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動相所占據(jù) 局部的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。顯然，固定相的粒度愈小，微孔孔徑 愈大，傳質(zhì)速率就愈快，柱效就高。對高效液相色譜固定相的設(shè)計 就是基于這一考慮。液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs可用下式表示：2Cs = -' s d f / Ds公式說明試樣分子從流動相進(jìn)

29、入固定液內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量交換的傳質(zhì)過 程與液膜厚度df平方成正比，與試樣分子在固定液的擴(kuò)散系數(shù)Ds成 反比。式中d s是與容量因子k有關(guān)的系數(shù)。氣相色譜速率方程和液相色譜速率方程的形式根本一致，主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項可忽略不計,影響柱效的主要因素 是傳質(zhì)阻力項。4. 流動相線 速度 對板 高的影響(1) LC和 GC的 H-u 圖根據(jù)va n D eemt er公式作LC和GC的H-u圖，LC和GC的H-u圖十分 相似， 對應(yīng)某一流速都有一個板高的極小值，這 個極小值就是柱效 最高點(diǎn)；LC板高極小值比GC的極小值小一個數(shù)量級以上，說明液相 色譜的柱效比氣相色譜高得多；LC的板高最低點(diǎn)相應(yīng)流速

30、比起GC的 流速亦小一個數(shù)量級，說明對于LC，為了取得良好的柱效，流速不 一定要很高。(2) 分子擴(kuò)散項和傳質(zhì)阻力項對板高 的奉獻(xiàn)較低線速時， 分 子擴(kuò)散項起主要作 用； 較高 線速時， 傳質(zhì) 阻力項起主要作用；其中流動相傳質(zhì)阻力項對板高的 奉獻(xiàn)幾乎是一 個 定 值 。在 高 線 速 度 時 ，固 定 相 傳 質(zhì) 阻 力 項 成 為 影 響 板 高 的 主 要 因 素， 隨著速度增高， 板 高值越來越大， 柱 效急劇下降。5. 固定相 粒度大小對板 高的 影響粒度越細(xì)， 板高 越小 ， 并且受線速 度影響亦小。這就是為什么在HPLC中采用細(xì)顆粒作固定相的根據(jù)。當(dāng)然，固定相 顆粒愈細(xì)， 柱流速愈

31、慢。 只有采取高壓技術(shù)， 流動相流速才能符合 實驗要求。第四 節(jié) 別離度別離度R是一個綜合性指標(biāo)。別離度是 既能反映柱效 率又能反映選擇性的 指標(biāo)， 稱總分 離 效能指標(biāo) 。分 離度又叫分 辨率，它 定 義為相鄰兩組分色譜峰保存值 之差與兩組分 色譜峰底寬總和之半的 比值 ， 即R = 2 (t r2t r 1 ) / W1 +W2R值越大，說明相鄰兩組分別離越好。一般說，當(dāng)R<1時，兩 峰有局部重疊；當(dāng)R=1時，別離程度可達(dá)98 %;當(dāng)R=1. 5時，別離程 度可達(dá)99.7 %通常用R=1. 5作為相鄰兩組分已完全別離的標(biāo)志。第五節(jié) 根本色譜別離方程式別離度受柱效(n)、選擇因子(a)

32、和容量因子(k)三個參數(shù)的控制。對于難別離物質(zhì)對，由于它們的分配系數(shù)差異小，可合理地假設(shè) k1k2=k，WW2 = Wo由n =16( t r /W 2得：1/ W =(n /4 )( 1 /t r)別離度R為：R=(n / 4)* (a -1/ a)(k/ 1+ k ) - ( 1)上式即為根本色譜別離方程式。在實際應(yīng)用中，往往用neff代替n 。2n =( 1 + k / k)neff根本的色譜方程的表達(dá)式：R = ( neff / 4)* ( a - 1 / a )-(2)1. 別離度與柱效的關(guān)系由公式(2)可以看出，具有一定相對保存值a的物質(zhì)對，分 離度直接和有效塔板數(shù)有關(guān)，說明有效塔

33、板數(shù)能正確地代表柱效能。由公式(1 )說明別離度與理論塔板數(shù)的關(guān)系還受熱力學(xué)性質(zhì) 的影響。當(dāng)固定相確定，被別離物質(zhì)對的a確定后，別離度將取決 于n。這時，對于一定理論板高的柱子，別離度的平方與柱長成正比,即2(Ri / R?) = n i / n2 = Li / L 2說明用柱長的色譜柱可以提高別離度，但延長了分析時間。 因此，提高別離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降 低板高，以提高別離度。2. 別離度與選擇因子的關(guān)系由根本色譜方程式判斷，當(dāng) a = 1時，R = 0。這時，無論怎 樣提高柱效也無法使兩組分別離。顯然，a大，選擇性好。研究證 明a的微小變化，就能引起別離度的顯著變化

34、。一般通過改變固定 相和流動相的性質(zhì)和組成或降低柱溫，可有效增大a值。3. 別離度與容量因子的關(guān)系如果設(shè) Q = (n/4) ( a -1 / a )，那么：R = Q * ( k /1+ k )當(dāng)k>10時，隨容量因子增大，別離度的增長是微乎其微的。 一般取k為21 0最宜。對于GC,通過提高溫度，可選擇適宜的k值， 以改良別離度。而對于LC，只要改變流動相的組成，就能有效地控 制k值。它對LC的別離能起到立竿見影的效果。4. 別離度與分析時間的關(guān)系當(dāng)k在2 5時，可在較短的分析時間，取得良好的別離度。第六節(jié) 色譜定性和定量分析一、色譜的定性分析色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化

35、合物。由于各 種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保存值，因此保存值可作為 一種定性指標(biāo)。目前各種色譜定性方法都是基于保存值的。但是不 同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保存值，即保存 值并非專屬的。因此僅根據(jù)保存值對一個完全未知的樣品定性是困 難的。如果在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的根底上，對樣品 組成作初步的判斷，再結(jié)合以下的方法那么可確定色譜峰所代表的化 合物。一利用純物質(zhì)對照定性在一定的色譜條件下，一個未知物只有一個確定的保存時間。 因此將純物質(zhì)在相同的色譜條件下的保存時間與未知物的保 留時間進(jìn)行比擬，就可以定性鑒定未知物。假設(shè)二者相同，那么未知物 可能是的純物質(zhì)；不同，那

36、么未知物就不是該純物質(zhì)。純物質(zhì)對 照法定性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比擬簡單，且有純物 質(zhì)的未知物。二相對保存值法相對保存值a is是指組分i與基準(zhǔn)物質(zhì)S調(diào)整保存值的比值a is = t ri / t rs'二 V ri / Vr s它僅隨固定液及柱溫變化而變化，與其它操作條件無關(guān)。相對保存值測定方法：在某一固定相及柱溫下，分別測出組 分i和基準(zhǔn)物質(zhì)s的調(diào)整保存值，再按上式計算即可。用已求出的相對保存值與文獻(xiàn)相應(yīng)值比擬即可定性。通常選容易得到純品的，而且與被分析組分相近的物質(zhì)作基 準(zhǔn)物質(zhì)，如正丁烷、環(huán)己烷、正戊烷、苯、對二甲苯、環(huán)己醇、環(huán) 己酮等。三參加物增加峰高法當(dāng)未知樣品中組

37、分較多，所得色譜峰過密，用上述方法不易 識別時，或僅作未知樣品指定工程分析時均可用此法。首先作出未 知樣品的色譜圖，然后在未知樣品參加某物，又得到一個色譜 圖。峰高增加的組分即可能為這種物。第六節(jié) 色譜定性和定量分析四保存指數(shù)定性法保存指數(shù)又稱為柯瓦Kov Ots指數(shù)，它表示物質(zhì)在固定液上的保存行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認(rèn)的定性指標(biāo)。它 具有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)。保存指數(shù)也是一種相對保存值，它是把正構(gòu)烷烴中某兩個組 分的調(diào)整保存值的對數(shù)作為相對的尺度，并假定正構(gòu)烷烴的保存指 數(shù)為n 100 o被測物的保存指數(shù)值可用內(nèi)插法計算。例如，假設(shè)確定物質(zhì)i在某固定液X上的保存指數(shù)

38、II的數(shù)值。 先選取兩個正構(gòu)烷烴作為基準(zhǔn)物質(zhì)，其中一個的碳數(shù)為Z 另一個 為Z+ 1，它們的調(diào)整保存時間分別為t R(Z)和t R( Z+ 1 )，使被測物質(zhì) i的調(diào)整保存時間t R( i )恰好于兩者之間，即t R( Z) : t R( i ): t R( Z+1 ) o將含物質(zhì)i和所選的兩個正構(gòu)烷烴的混合物注入其固定液X的色譜 柱，在一定溫度條件下繪制色譜圖。大量實驗數(shù)據(jù)說明，化合物調(diào) 整保存時間的對數(shù)值與其保存指數(shù)間的關(guān)系根本上是一條直線關(guān) 系。據(jù)此，可用內(nèi)插法求算I iX oI 1 x = 10 0 Z + ( lg t R(i)- lg t r(z) / ( lg t r(z+i)-

39、 lg t r(z)保存指數(shù)的物理意義在于：它是與被測物質(zhì)具有相同調(diào)整保 留時間的假想的正構(gòu)烷烴的碳數(shù)乘以100 o保存指數(shù)僅與固定相的 性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實驗條件無關(guān)。其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好。 只要柱溫與固定相相同，就可應(yīng)用文獻(xiàn)值進(jìn)行鑒定，而不必用純物 質(zhì)相對照。(五) 其它方法二、定量分析定量分析的任務(wù)是求出混合樣品中各組分的百分含量。色譜 定量的依據(jù)是，當(dāng)操作條件一致時，被測組分的質(zhì)量(或濃度)與 檢測器給出的響應(yīng)信號成正比。即：f i * Ai式中為被測組分i的質(zhì)量；Ai為被測組分i的峰面積；f i為被測組分i的校正因子?？梢姡M(jìn)行色譜定量分析時需要：(1) 準(zhǔn)確測量檢測器的響應(yīng)信

40、號一 峰面積或峰高；(2) 準(zhǔn)確求得比例常數(shù)一校正因子；(3) 正確選擇適宜的定量計算方法，將測得的峰面積或 峰高換 算為組分的百分含量。(一)峰面積測量方法峰面積是色譜圖提供的根本定量數(shù)據(jù)，峰面積測量的準(zhǔn)確與 否直接影響定量結(jié)果。對于不同峰形的色譜峰采用不同的測量方 法。(1) 對稱形峰面積的測量一一峰咼乘以半峰寬法對稱峰的面積 A = 1. 065 hW/2(2) 不對稱形峰面積的測量峰高乘平均峰寬法對于不對稱峰的測量如仍用峰高乘以半峰寬，誤差就較大， 因此采用峰高乘平均峰寬法。A = 1/2 h ( W. 15 + Wo. 85)式中W0.15和 W0. 85分別為峰高0. 15倍和0.

41、 85倍處的峰寬。(二 )定量校正因子色譜定量分析的依據(jù)是被測組分的量與其峰面積成正比。但 是峰面積的大小不僅取決于組分的質(zhì)量，而且還與它的性質(zhì)有關(guān)。 即當(dāng)兩個質(zhì)量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢測器進(jìn)行 測定時，所得的峰面積卻不相同。因此，混合物中某一組分的百分 含量并不等于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所占的百分 率。這樣，就不能直接利用峰面積計算物質(zhì)的含量。為了使峰面積 能真實反映出物質(zhì)的質(zhì)量，就要對峰面積進(jìn)行校正，即在定量計算 是引入校正因子。校正因子分為絕對校正因子和相對校正因子。f i = m / A式中fi值與組分i質(zhì)量絕對值成正比，所以稱為絕對校正因子。 在定量分析時要

42、精確求出f i值是比擬困難的。一方面由于精確測量 絕對進(jìn)樣量困難；另一方面峰面積與色譜條件有關(guān)，要保持測定f i 值時的色譜條件相同，既不可能又不方便。另外即便能夠得到準(zhǔn)確 的f i值，也由于沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)而無法直接應(yīng)用。為此提出相對校 正因子的概念來解決色譜定量分析中的計算問題。1. 相對校正因子相對校正因子定義為f i = f i / f s即某組分i的相對校正因子f i 為組分i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的絕對校正 因子之比。f= m/Ai / ms / As = m / ms * As / A 可見，相對校正因子f i 就是當(dāng)組分i的質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s相等時，標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積是組分i峰面積的倍數(shù)。假

43、設(shè)某組分質(zhì)量為m ,峰面 積Ai ，那么f i A的數(shù)值與質(zhì)量為m的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積相等。也就 是說，通過相對校正因子，可以把各個組分的峰面積分別換算成與 其質(zhì)量相等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，于是比擬標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一了。這就是 歸一法求算各組分百分含量的根底。2. 相對校正因子的表示方法上面介紹的相對校正因子中組分和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是以質(zhì)量表示 的，故又稱為相對質(zhì)量校正因子；假設(shè)以摩爾為單位，相對摩爾校正 因子；另外相對校正因子的倒數(shù)還可定義為相對響應(yīng)值S 分別為 相對質(zhì)量響應(yīng)值Sw、相對摩爾響應(yīng)值Sn '0通常所指的校正因子都 是相對校正因子。3. 相對校正因子的測定方法相對校正因子值只與被測物和標(biāo)準(zhǔn)物以及檢測器的類型有關(guān)，而與操作條件無關(guān)。因此，f值可自文獻(xiàn)中查出引用。假設(shè)文 獻(xiàn)中查不到所需的f /值，也可以自己測定。常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對 熱導(dǎo)檢測器TCD是苯，對氫焰檢測器F