1、卵母細胞和胚胎玻璃化解凍方法.用途：本品用于卵母細胞和胚胎的玻璃化解凍配套。平安解凍配套：1. 1瓶4ml解凍液TS2. 1瓶1.5ml稀釋液(DS)3. 1瓶1.5ml 沖洗液(WS)4. 1個25mm 的培養皿(用于解凍液)5. 1個6孔生殖板使用說明準備：*用載體和生殖板將解凍液放到37的培養箱里加溫將所有解凍液倒入生殖板里。*用微細管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放進培養皿。注意：用巴斯德管吸取一個大小適宜的卵母細胞直徑：140um或者胚胎(直徑：140-180um)解凍：1. 迅速地將載體頂放進解凍液中，浸泡1分鐘。圖一2. 用巴斯德管吸取卵母細胞胚胎，輕輕地將其放入DS底部

2、，浸泡3分鐘。圖二3. 用巴斯德管吸起卵母細胞胚胎，輕輕地將其放入WS1 底部，浸泡5分鐘。圖三4. 用巴斯德管吸起卵母細胞胚胎，輕輕地將其放入WS2 頂部，當卵母細胞胚胎自動沉到底部的時候，重新再重復這一步驟。圖四5. 將卵母細胞胚胎轉移到裝有適宜培養液的培養皿中。放進37的培養箱中完成恢復。注意：卵母細胞要放置2小時，胚胎那么要3小時。質量控制測試：每一批平安解凍配套都得到以下測試：*溶液：UPS不孕不育無菌測試SAL 10-3 LAL拉爾內毒素測試 小老鼠胚胎試驗一個細胞保存方法：*保存于4-8*在標簽所示有效日期前，本品性質穩定。成分：*血清替代補充*根本培養基M-199 內含的HEP

3、ES*蔗糖參考文件此局部請看原件.玻璃化第一局部：所需材料*玻璃化配套No.0 根底液BS：1.5ml x1 (只用于卵母細胞玻璃化冷凍)No.1 稀釋液ES: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液VS: 1.5ml x2*冷凍管x4, 建議每個冷凍管最多儲存3個卵母細胞或者3個胚胎*復制板x2: 6孔*冷卻架(藍盒液氮，型號：VT-CLB)*巴斯德管型號：MT-150*顯微鏡關掉加熱板*秒表或計算器帶計算功能*液氮消毒過濾功能，聚四氟乙烯濾膜過濾*鑷子*顯微針x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*儲存罐注意：使用的巴斯德管大小要與卵母細胞或胚胎大小適宜。卵母細胞內直徑：140

4、um，胚胎內直徑：140-200um，盡量減少與玻璃解凍液的接觸以提高解凍后的成活率。平衡這個步驟，卵母細胞與胚胎步驟不一樣。第二局部 玻璃化準備1. 將BS、ES和VS放到室溫25-27。2. 在管上寫上客戶信息3. 冷卻架要添加液氮至90%4. 將裝有卵母細胞或者胚胎的培養皿從培養箱中取出，用巴斯德管取出卵母細胞或者胚胎在顯微鏡下觀察卵母細胞或胚胎的質量狀況。比擬卵黃周隙與透明帶的寬度，并做記錄,這樣更容易知道在ES浸泡后完成平衡液步驟。卵黃周隙透明帶注意：如果用的是卵母細胞那么要將積云細胞出去。 第三局部 平衡卵母細胞平衡1在復制板邊上分別寫上BS, VS1和VS2.用巴斯德管取出20u

5、l的BS，300ul VS1和300ul VS2,放進復制板里看下列圖。卵母細胞平衡2用巴斯德管取出卵母細胞，將其轉移到BS20ul溶液底部。卵母細胞平衡3 (3分鐘)調整秒表有計算功能，為以下步驟檢查并設定好秒表。沿著復制板孔的邊緣移動巴斯德管，輕輕地將20ul ES增加到有卵母細胞BS溶液的頂部，放置3分鐘。 卵母細胞平衡4 (3分鐘)仿照上個步驟再增加20ul ES溶液到頂部，放置3分鐘。 卵母細胞平衡5 (9分鐘)仿照上個步驟再增加240ul ES溶液到頂部，放置9分鐘。在平衡液這個局部，卵母細胞大小要完全恢復，在卵母細胞在ES浸泡前，卵黃周隙寬度平均的時候，這個局部就完成了。 玻璃化

6、配套胚胎平衡胚胎-平衡1在復制板邊上分別寫上ES, VS1和VS2.將 將ES和兩瓶VS充分混合。用巴斯德管分別取出300ul 溶液，立刻放進復制板里看右圖。胚胎-平衡2用巴斯德管吸取胚胎于巴斯德管頂部，看右圖。然后將胚胎放到ES中頂部。胚胎-平衡3 12到15分鐘調整秒表有計算功能，為以下步驟檢查并設定好秒表。胚胎于30秒內自由脫落，它會自發地開場收縮，在ES滲透后，胚胎就會逐漸恢復到原來的大小，此時平衡步驟就完成了。注意：胚泡平衡要等待卵黃周隙消失。胚泡玻璃化解凍最好的時候是胚胎直徑到達140-180ul的時候。胚胎平衡的時間取決于胚胎的大小和質量，好的胚胎和小的胚胎所需時間就比擬少。舉例

7、來說，一個好的胚胎8分鐘完全恢復，平衡步驟已經完成。如果不能確定胚胎是否完全恢復，那么停頓平衡，12分鐘進展原核細胞分裂， 15分鐘進入桑椹胚和囊胚階段，這樣就足夠了。第四局部 玻璃化這個局部對于卵母細胞和胚胎都是一樣的，以下1到7步驟應在60-90秒內完成。玻璃化 1從ES溶液中用巴斯德管頂吸出卵母細胞胚胎，看右圖。然后將胚胎胚胎放到VS1中頂部,盡量減少攜帶ES溶液。僅將卵母細胞胚胎帶進VS1，為了防止將ES帶進VS1，首先將ES吹到孔的外邊，將新鮮的VS1吹到孔的外面，用VS1吸入巴斯德管內。玻璃化21分鐘內用巴斯德管吸入卵母細胞胚胎并放入VS1，在卵母細胞胚胎周圍快速地攪拌5次。重新吸

8、入卵母細胞胚胎，在另外的位置放下VS1，在其周圍快速地攪拌3次。改變卵母細胞胚胎周圍的VS1溶液，直到ES溶液視覺上消失了。玻璃化30.5分鐘將巴斯德管內的VS1溶液吹到孔外，將VS2溶液吸入巴斯德管，然后從VS1溶液中將卵母細胞胚胎吸入巴斯德管。將其放入VS2中，盡量減少帶入VS1。在卵母細胞胚胎周圍快速地攪動，變換2次位置，請看上圖。當卵母細胞胚胎周圍全被VS溶液包圍并能觀察到卵母細胞胚胎外表因脫水而萎縮時，此步驟即完成。玻璃化4將載體放在顯微鏡下觀察標簽要朝上，調整將重點放在載體黑色標志上面。看下列圖。玻璃化4將載體放在顯微鏡下觀察標簽要朝上，調整將重點放在載體黑色標志上面。看下列圖。玻

9、璃化5用巴斯德管從VS2吸取收縮了的卵母細胞胚胎，將卵母細胞胚胎放在載體的黑體位置，盡量減少帶入VS2(少于1ul), 如果超過2個卵母細胞胚胎，每個卵母細胞胚胎要1滴。看右圖。在載體上除去VS將卵母細胞放在載體后，用吸液管將多余的VS液體吸去。將吸液管頂部放在VS液底部將吸液管橫向拉開液體，使VS液體降低吸取多余的VS液，盡量減少VS留下，但不能吸去卵母細胞胚胎好樣板不好的樣板在載體黑色局部有1滴平面VS液體，在載體黑色旁邊有立體的VS液滴，VS2太多玻璃化6在顯微鏡下觀察載體上的卵母細胞胚胎是否會有太多的VS液體，快速地將載體放入液氮中。玻璃化7用鑷子夾住管帽，將載體尾端插入液氮中，然后用

10、帽蓋將載體擰緊。用鑷子夾住管帽，將載體插入用手拿著管帽，套好擰緊管帽，確定管帽扣緊載體玻璃化8檢查管帽是否擰緊，將載體放入罐子里然后放入儲存罐注意：載體紙要一直放在液氮中，直到將其放入儲存罐中，當有需要將載體轉移到其他儲存罐時，其中的時間要將載體放在液氮中，在解凍之前不能將載體暴露在空氣中。解凍*第一局部 需要材料玻璃化解凍配套No.1 解凍液TS:1x4mlNo.2 稀釋液DS:1x1.5mlNo.3 沖洗液WS:1x1.5mlNo.4 培養皿：TS用35mmNo.5 復制板：6孔*冷卻架(藍盒液氮，型號：VT-CLB)*巴斯德管型號：MT-150*顯微鏡關掉加熱板*秒表或計算器帶計算功能*

11、液氮消毒過濾功能，聚四氟乙烯濾膜過濾*鑷子*顯微針: 100-1000 ul*罐子*儲存罐注意：使用的巴斯德管大小要與卵母細胞或胚胎大小適宜。卵母細胞內直徑：140um，胚胎內直徑：140-200um，盡量減少與玻璃解凍液的接觸以提高解凍后的成活率。第二局部 解凍準備1. 用培養皿裝TS密封放進培養箱37回暖大于1.5小時2. 將DS,WS置于室溫內25-273. 取回裝有載體的罐子，快速地將罐子插入裝滿液氮的冷卻架中。取回冷卻架的罐子，檢查載體上標注的病人信息。注意：用體視顯微鏡放置好冷卻架3. 在復制板邊上分別寫上DS, WS1和WS2. 將1瓶DS和兩瓶WS充分混合。用巴斯德管分別取出3

12、00ul 溶液，立刻放進復制板里看右圖。將復制板放在顯微鏡下觀察。從培養箱取出TS溶液和培養皿，反轉TS兩次，使溶液均勻后將全部倒入培養皿中。4.將顯微鏡重點對準裝有TS的培養皿，用巴斯德管確定顯微鏡對準培養皿正中間。.解凍第三局部 解凍解凍1輕輕地擰開和除去在液氮中的載體管帽，豎立在冷卻架的邊角。解凍2準備好用巴斯德管將載體固定在液氮中，設置好秒表有計算功能。為以下步驟檢查并設定好秒表。解凍3快速地將載體放入在顯微鏡下的TS，時間應為1秒鐘看左下列圖。卵母細胞胚胎要在載體黑色局部中間。泡在TS 1分鐘，卵母細胞胚胎與載體紙別離后，輕輕地用巴斯德管吸取卵母細胞胚胎，就算卵母細胞胚胎沒與載體別離也要將其吸入巴斯德管。同樣，吸取TS液，知道卵母細胞胚胎到達巴斯德管頂2mm.第四局部 稀釋稀釋3分鐘慢慢地從巴斯德管將TS液放入DS液 底部，然后慢慢地將卵母細胞胚胎放到DS液 的TS底層。放置3分鐘，這個步驟是將卵母細胞胚胎從TS逐漸轉移到DS液中。 第五局部 沖洗沖洗1需時5分鐘浸泡在DS液中3分鐘后，用巴斯德管從DS液中輕輕地吸取卵母細胞胚胎，同時，吸入DS液，直到卵母細胞胚胎離巴斯德管頂2mm。 首先只將巴斯德管里的DS液放入在WS1 底部，然后輕輕地將卵母細胞胚胎放入到WS1底部的DS層里。這個步驟主要是將卵母細胞胚胎逐漸從DS液轉移到WS中。沖洗