1、1.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？真核生物：真核基因組龐大。存在大量的重復(fù)序列。大部分為非編碼序列(>90)。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。是斷裂基因，有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。存在大量的順式作用元件(啟動子、增強(qiáng)子、沉默子)。存在大量的DNA多態(tài)性。具有端粒(telomere)結(jié)構(gòu)原核生物：基因組很小，大多只有一條染色體，且DNA含量少。主要是單拷貝基因，只有很少數(shù)基因如rRNA基因以多拷貝形式存在。整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成； 幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對應(yīng)狀態(tài)1.試述基因克隆載體進(jìn)化過程。pSC101質(zhì)粒載體，第一個基因克隆載體ColE1質(zhì)

2、粒載體，松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒載體，具有較小的分子量（4363 bp）。能攜帶6-8 kb的外源DNA片段，操作較為便利pUC質(zhì)粒載體，具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)pGEM-3Z質(zhì)粒，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ'基因穿梭質(zhì)粒載體，由人工構(gòu)建的具有原核和真核兩種不同復(fù)制起點和選擇標(biāo)記，可在不同的寄主細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體pBluescript噬菌粒載體，一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體2.試述PCR擴(kuò)增的原理和步驟。對比DNA體內(nèi)復(fù)制的差異。原理：首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模

3、板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸、合適的Mg2+濃度和實驗中提供的引物序列合成新生的DNA分子。步驟：將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（>94）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA降低反應(yīng)溫度（退火，約50），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上將反應(yīng)混合物的溫度上升到72左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈與體內(nèi)復(fù)制的差別：PCR不產(chǎn)生岡崎片段在高溫條件下反應(yīng)，不需要DNA解旋酶PC

4、R可經(jīng)過多個循環(huán)在體外進(jìn)行，可調(diào)控第六章1.基因敲除原理：又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點方法：高等動物基因敲除技術(shù)，植物基因敲除技術(shù)2.完全基因敲除和條件型基因敲除完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動植物個體中的靶基因活性，條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除3.基因定點突變原理：通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列

5、、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點等方法：重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法第七章1.乳糖操縱子的正負(fù)調(diào)控（）阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有誘導(dǎo)物時，誘導(dǎo)物結(jié)合阻遏蛋白，此刻聚合酶與啟動子形成開放式啟動子復(fù)合物轉(zhuǎn)錄乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因。當(dāng)無誘導(dǎo)物時，阻遏蛋白結(jié)合與啟動子與蛋白質(zhì)部分重疊不轉(zhuǎn)錄。（=）CAP正調(diào)控當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺少葡萄糖時ATPCAMP結(jié)合，CRP生成CAP與CAP位點結(jié)合，增前RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)有葡萄糖存在時CAMP分解多合成少，CAP不與啟動子上的CAP位點結(jié)合RNA聚合酶不與操縱區(qū)結(jié)合無法起始轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因表達(dá)下降2.色氨酸可阻遏、可誘導(dǎo)操縱子3.真核與原核生物基因轉(zhuǎn)錄有哪些差異？（1）只有

6、一種RNA聚合酶參與所有類型的原核生物基因轉(zhuǎn)錄，而真核生物有3種以上的RNA聚合酶來負(fù)責(zé)不同類型的基因轉(zhuǎn)錄，合成不同類型的、在細(xì)胞核內(nèi)有不同定位的RNA（2）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有差別。原核生物的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大多數(shù)是編碼序列，與蛋白質(zhì)的氨基酸序列呈線性關(guān)系；而真核生物的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很大，含有內(nèi)含子序列，成熟的mRNA只占初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一小部分（3）原核生物的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物幾乎不需要剪接加工，就可直接作為成熟的mRNA進(jìn)一步行使翻譯模板的功能；真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要經(jīng)過剪接、修飾等轉(zhuǎn)錄后加工成熟過程才能成為成熟的mRNA（4）在原核生物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個細(xì)胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進(jìn)行的

7、，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā)了。真核生物mRNA的合成和蛋白質(zhì)的合成則發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi)7.蛋白質(zhì)有哪些翻譯后的加工修飾？其作用機(jī)制和生物學(xué)功能是什么？N端fMet或Met的切除細(xì)菌蛋白質(zhì)氨基端的甲酰基能被脫甲酰化酶水解，不管是原核生物還是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽鏈合成完畢之前就被切除。二硫鍵的形成mRNA中沒有胱氨酸的密碼子，而不少蛋白質(zhì)都含有二硫鍵，這是蛋白質(zhì)合成后通過兩個半胱氨酸的氧化作用生成的。二硫鍵的正確形成對穩(wěn)定蛋白的天然構(gòu)象具有重要的作用。特定氨基酸的修飾氨基酸側(cè)鏈的修飾作用包括磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化、羥基化和羧基化等。切除新

8、生肽鏈中的非功能片段由多個肽鏈及其他輔助成分構(gòu)成的蛋白質(zhì)，在多肽鏈合成后還需經(jīng)過多肽鏈之間以及多肽鏈與輔基之間的聚合過程，才能成為有活性的蛋白質(zhì)簡述大腸桿菌基因組和真核生物基因組的主要區(qū)別答：1、真核生物基因組指一個物種的單倍體染色體組(1n)所含有的一整套基因。還包括葉綠體、線粒體的基因組。 原核生物一般只有一個環(huán)狀的DNA分子，其上所含有的基因為一個基因組。2、原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序（unique-sequences），DNA僅有少量的重復(fù)順序和基因。真核生物基因組存在大量的非編碼序列。包括：.內(nèi)含子和外顯子、.基因家族和假基因、重復(fù)DNA序列。真核生

9、物的基因組的重復(fù)順序不但大量，而且存在復(fù)雜譜系。3、原核生物的細(xì)胞中除了主染色體以外，還含有各種質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子。質(zhì)粒常為雙鏈環(huán)狀DNA，可獨(dú)立復(fù)制，有的既可以游離于細(xì)胞質(zhì)中，也可以整合到染色體上。轉(zhuǎn)座因子一般都是整合在基因組中。真核生物除了核染色體以外，還存在細(xì)胞器DNA，如線粒體和葉綠體的DNA，為雙鏈環(huán)狀，可自主復(fù)制。有的真核細(xì)胞中也存在質(zhì)粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA位于細(xì)胞的中央，稱為類核（nucleoid）。真核生物有細(xì)胞核，DNA序列壓縮為染色體存在于細(xì)胞核中。5、真核基因組都是由DNA序列組成，原核基因組還有可能由RNA組成，如RNA病毒。 第七章1.簡述代謝物

10、對基因表達(dá)調(diào)控的兩種方式。 答： 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控；  轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控 ，包括mRNA加工成熟水平上的調(diào)控和翻譯水平上的調(diào)控 3.簡述乳糖操縱子的調(diào)控模型。 答：A、乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含 Z、Y、A 三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列 O，一個啟動子 P 和一個調(diào)節(jié)基因I。     B、阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時，I 基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操

11、縱序列 O 處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。 C、CAP 的正性調(diào)節(jié)：在啟動子上游有 CAP 結(jié)合位點，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境 時，cAMP 濃度升高，與 CAP 結(jié)合，使 CAP 發(fā)生變構(gòu)，CAP 結(jié)合于乳糖操縱子啟動序列附近的 CAP 

12、;結(jié)合位點，激活 RNA 聚合酶活性，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對乳糖操縱子實行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。D、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的 I 基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與 CAP 的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。 5.什么是弱化作用？ 答：1.當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸的濃度很低時，負(fù)載有色氨酸的tRNATrp也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個相鄰的trp密碼子處），這時的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3配對，不形成3-

13、4配對的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到將trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄。  2.當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸濃度較高時，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達(dá)2區(qū)，使2-3區(qū)不能配對，3-4區(qū)自由配對形成基一環(huán)終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄被終止，trp操縱子被關(guān)閉。  怎么去掉模板呢？再簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會影響

14、PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會那么湊巧吧，哈哈。關(guān)于第三個問題：直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，呵呵，然后再篩選出陽性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測序（這個就不用我多說了吧），驗證突變結(jié)果，一般都沒問題的啦，我做了幾十個突變了，到目前為止還沒有做不出來的，呵呵，不要砸我啊。要使動物中編碼激素的基因在大腸桿菌中表達(dá)，通常遇到的問題有： (1)細(xì)菌的RNA聚合酶不能識別真核生物的啟動子。 (2)大多數(shù)真核基因有內(nèi)含子，這些內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄后從前體mRNA中被切除而形成成熟mRNA。細(xì)菌細(xì)胞沒有這樣的機(jī)制來去除內(nèi)含子。 (3)有些真

15、核生物的蛋白質(zhì)是通過前體分子加工而來的，例如胰島素就是通過加工去除 前體分子內(nèi)部的33個氨基酸殘基而來，剩下的兩段肽鏈分別形成胰島素的a、b鏈。 (4)產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以被細(xì)菌的蛋白酶所識別和降解。 針對上述可能出現(xiàn)的問題，建議在克隆的過程中采取以下措施： 應(yīng)將激素的編碼序列置于含有核糖體結(jié)合位點和起始密碼子ATG的細(xì)菌強(qiáng)啟動子的附近(含有這種序列的載體稱表達(dá)載體)。 可以以激素的mRNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶合成激素的基因。這種DNA不含內(nèi)含子可插入到載體中進(jìn)行克隆。此外，如果蛋白質(zhì)序列短則可通過化學(xué)合成得到該基因。合成的基因應(yīng)含起始密碼ATG、通過該激素蛋白的氨基酸序列推測而來的編碼序列，以及12個終止密碼： ATG編碼序列TGA TAG 現(xiàn)在，這個合成基因可被插入載體中。 有時加工過程可以在離體條件下進(jìn)行。如果加工有困難，可以用合成基因