1、1 ChIP實驗通過與染色質(zhì)片段共沉淀和PC叱術(shù)，在體內(nèi)檢測與特異蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA段。將處于適當(dāng)生長時期的活細胞用甲醛交聯(lián)后將細胞裂解，染色體分離并打碎為一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特異性抗體免疫沉淀目標(biāo)蛋白與DNA交聯(lián)的復(fù)合物，對特定靶蛋白與DNA片段進行富集。采用低pH值條件反交聯(lián)，DNA與蛋白質(zhì)之間的Schiff鍵水解，釋放DNA片段。通過對目標(biāo)片段的純化與檢測，獲彳導(dǎo)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的序列信息。Step工CrosslinkingStep2：CeltLysisStep4:ImnunoprecipilolionStep5：CrosslinkingReversala

2、ndDNAClean-upi生物2 RIP實驗RIP技術(shù)(RNABindingProteinImmunoprecipitation,RNA吉合蛋白免疫沉淀)，是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA灰白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA®行分析；即用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA吉合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來，結(jié)合的RNA列通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

3、網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。多聚核糖體(Posone)裂解液中迸行裂解使用A/G蛋白磁珠及抗體對目標(biāo)崔亡進行免疫沉淀利用國性固定與磁珠結(jié)合的短合物并疏脫未結(jié)合的物質(zhì)RN總拄取K屈0MoqM比6eodOSerpr+t&rsAivibody。卡ognfl賽誠生物F圖3RIP實驗流程3 RNApull-down實驗使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA金白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過westernblot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNAt目互作用。La

4、belRNAusingT4rnaligase2.CapturelabeledftNAwithstreptovidinmagneticbeads3.EtuteWashdetectWestonNQlfn?$1repavidinMunulic賽誠生物gzscbioromBindproteinstoRNA4 EMSA實驗?zāi)z遷移或電泳遷移率實驗(EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay)是一種研究DNA吉合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于研究DNA吉合蛋白和其相關(guān)的DNA吉合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同

5、，可是雙鏈或者是單鏈。mo嚓,ProteinSpecificcompetitorMutant/noncompetitcr廣州賽誠生物www.g之$。切。.8個圖5EMSA實驗原理5 Luciferase實驗熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發(fā)光反應(yīng)。螢光生成反應(yīng)通常分為以下兩步：螢光素+AT4螢光素化腺甘酸(luciferyladenylate)+PPi螢光素化腺甘酸+O2一氧螢光素+AMP+光熒光素酶的基因可以被合成并插入到生物體中或轉(zhuǎn)染到細胞中，將不同類型的細胞(骨髓干細胞、T細胞等)標(biāo)記上(即表達)

6、熒光素酶，就可以用高敏感度的CCDf機進行對動物體內(nèi)進行活體觀察而不會傷害到動物本身。在熒光素酶中加入正確的螢光素底物就可以放出熒光，而發(fā)出的光子可以被光敏感元件，如螢光探測器或改進后的光學(xué)顯微鏡探測到。這就使得對包括感染在內(nèi)的多種生命活動進程進行觀察成為可能。Promoter/Enhanc&r廣州賽遮生物,g2&ctnocomPotentialregulatory&proteinNon-combinationNormal圖6Luciferase研究增強子原理SlirOXtcrw*nllwfcw"X-T!->MjrQf，N«rV1Sxnflw&

7、amp;cW1pGL4VectorWWbbAgbflOQflrxidiirti；一0SIWQTVWQflW&jeHI44S1SVJOIate-poly(A)5叫叼1：HSVTK.pwnwerfpBiCHECK-2Voctor科ytllZ呢4蠢出眥n_XholKV40EartyEnhamxMPromciMrNW£84圖7Luciferase常用載體CleavewithrestrictionenzymeatAB/DigestwithexonucleaseB0min1min2min3min4minAttachlinkerwithDNAligase圖8Luciferase片段缺失分析

8、實驗流程TemplateNAPCRwithmutagenicprimerMixremoveprimersdenaturereannealPCRwithendprimers廣州賽誠生物圖9Luciferase定點突變分析實驗流程熒光素酶分析可應(yīng)用于啟動子研究中分析順式作用元件和反式作用因子、藥物篩選、siRNA和miRNA篩選、分泌途徑及蛋白定位報告基因檢測、活細胞的實時動態(tài)研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析、難轉(zhuǎn)染的細胞（包括干細胞和原代細胞）的研究、RNA剪接研究。雙熒光素酶報告基因測試，是結(jié)合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進的共報告基因測試技術(shù)。在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時，通常采用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。雙熒光素酶報告基因測