1、分子生物學考試重點（前四章+第七、八章）第一章一、DNA重組技術和基因工程技術 （p12）答：DNA重組技術：將不同的DNA片段，按照人們的設計定向連接起來，于特定的受體細胞中和載體一起復制并得到表達，產生影響受體的新的遺傳性狀的技術。基因工程技術：除DNA重組技術外還包括其他對生物細胞基因組結構進行改造的體系。關鍵：工具酶的發現和應用前景：1、合成正常細胞中含量很低的多肽 2、定向改造基因組結構 3、進行基礎研究二、請簡述現代分子生物學的研究內容。（第二版前言、p12標題）答：分子生物學：研究核酸等生物大分子的功能、形態、結構特征的重要性和規律性的科學，主要關心的是核酸在細胞生命過程中的作用

2、，包括核酸的復制和保存、基因的表達和調控。 研究內容：DNA重組技術，基因的調控和表達，生物大分子的功能結構結構分子生物學，基因組、功能基因組和生物信息學。第二章一、核小體（P27）答：核小體：由H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成的八聚體和約200bp的DNA組成。八聚體在內，DNA盤繞在外。其是DNA壓縮的第一步。若用核酸酶降解核小體，只能得到約146bp的核心顆粒。（另：H1在核小體的外面）核心顆粒：除去接頭DNA的核小體單體，長度約146bp核小體單體：八聚體+200bpDNA組成，包括接頭DNA二、DNA的半保留復制（p38）答：DNA在復制過程中，堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋

3、解鏈，每條單鏈分別作為模板合成新鏈。新生成的DNA分子與原DNA分子的堿基順序完全一樣，這樣每個子代分子的DNA一條單鏈來自模板鏈，另一條單鏈來自新合成的鏈，這種復制方式成為DNA的半保留復制。三、轉座子（p57）答：轉座子是存在于DNA上的可以自主復制和移動的基本單位，其可以分為兩大類：插入序列和復合型轉座子，另外還有TnA家族。四、DNA的一、二、三級結構特征。（P32p37）答：1、各級結構的定義：DNA的一級結構：指四種核苷酸的連接和排列順序DNA的二級結構：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結構DNA的三級結構：在DNA雙螺旋基礎上進一步扭曲盤繞所形成的特定空間結構。2、各級

4、結構的特點：DNA一級結構：（1）、DNA分子是由兩條脫氧核苷酸長鏈盤繞而形成的。（2）、脫氧核糖和磷酸交替連接，在外側形成骨架；堿基排列在內側。 （3）、堿基之間按照互補配對的原則以氫鍵連接（AT、CG）。DNA二級結構：（1）、右手螺旋（A-DNA、B-DNA） 、雙螺旋之間有凹槽，小溝1.2（nm）大溝2.2（nm） 、堿基之間以氫鍵連接，堿基平面與縱軸垂直，螺旋的軸心穿過氫鍵的中點、堿基平面距離0.34nm，雙螺旋直徑2.0nm，每十個核苷酸為一個結構重復周期。 （2）、左手螺旋（Z-DNA）是右手螺旋結構模型的一個補充和發展DNA三級結構：（1）、超螺旋是其三級結構的主要形式，分為正

5、超螺旋與負超螺旋。在不同的拓撲異構酶的作用下可以相互轉變。 （2）、DNA分子的變化滿足公式：L=T+W（連接數旋轉數+超螺旋數） （3）、雙螺旋DNA的松開導致負超螺旋、擰緊導致正超螺旋。五、DNA復制通常采取哪些方式？（p40）答：（1）線性DNA雙鏈復制：，復制叉方向：單一起點單向、雙向，或多起點雙向，特殊機制：I，線性的復制子形成環狀或多聚分子 II，末端形成發卡結構 III，特殊蛋白介入，在真正末端啟動復制 （2）環狀DNA雙鏈復制：型、滾環型、D環型六、真核生物DNA的復制在哪些水平上受到調控？（p51）答：真核細胞生活周期：G1期：復制預備期、S期：復制期、G2期：有絲分裂預備期

6、、M期：有絲分裂期。 調控方式：（1）、細胞生活周期水平調控：決定是否從G1期進入S期 （2）、染色體水平調控：決定不同染色體或者同一染色體的不同部位的復制子按一定順序在S周期進行復制 （3）、復制子水平調控：決定復制子是否進行復制七、DNA 修復包括哪幾種？p51p55答：1、錯配修復：通過復制前母鏈甲基化來識別錯配的子鏈，根據“保留母鏈，修復子鏈”的原則，通過兩種方式（3端、5端）剪切和合成新鏈修復。 2、切除修復：（1）、堿基切除修：<1>、糖苷水解酶：水解受損核苷酸上的N糖苷鍵，形成去堿基位點（即AP位點）<2>、AP核酸內切酶：將受損核酸的糖苷磷酸鍵切開<

7、;3>、DNA聚合酶：合成新的片段<4>、DNA連接酶：連接，完成修復（2）、核苷酸切除修復：通過DNA切割酶和DNA聚合酶實現修復 <1>、DNA切割酶：切割損傷部位的磷酸糖苷鍵<2>、DNA聚合酶（原核）或（真核）：合成新片段<3>、DNA連接酶：連接，完成修復3、重組修復：又稱復制后修復，復制時跳過損傷部位，之后通過DNA重組修復4、直接修復：不通過切除來修復，如DNA光解酶使環丁烷胸腺嘧啶二聚體或64光化物還原成單體。5、SOS修復：誘導DNA修復，誘變反應，細胞分裂的抑制，溶原性細菌釋放噬菌體等。細胞癌變也與SOS修復有關第三章一

8、、Pribnow box（P76）答：為原核生物指導轉錄的DNA模板鏈上一段由5個核苷酸（TATAA）組成的共同序列，其為RNA聚合酶緊密結合點，其又位于起始位點上游10bp處，故又稱10區。二、編碼鏈（p66）答：將與mRNA序列堿基順序相同的那條DNA單鏈稱編碼鏈，又稱有義鏈；另一條根據堿基互補配對原則指導mRNA合成的DNA單鏈稱為模板鏈，又稱反義鏈。三、上升突變（p78）答：細菌中常見兩種突變：上升突變、下降突變，上升突變指：增加pribnow box的共同序列的同一性能夠提高啟動子的效率，從而提高基因的轉錄水平的一種突變。例如乳糖操縱子中的pribnow區的TATGTT變為TATAT

9、T能夠提高操縱子的基因轉錄水平。四、增強子（p78）答：是除啟動子以外與轉錄起始有關的序列，一般位于200bp處，能夠增強轉錄起始。特點：遠距離效應、順式調節、可對外部信號有反應；無方向、有相位；無物種基因特異性、有組織特異性。五、簡述生物體內RNA的種類和功能（P67）答：（1）mRNA：編碼特定蛋白質序列 （2）tRNA： 識別mRNA中的遺傳信息，將其轉化為相應的氨基酸后加入到多肽鏈中 （3）rRNA： 直接參與核糖體內的蛋白質合成（為最多的RNA）六、什么是DNA模板與mRNA及蛋白質產物之間的共線性關系？（p67）答：書上67頁圖31七、轉錄一般被分為哪幾個步驟？（p67p69）答：

10、模板識別：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并結合的過程轉錄起始：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈結合后，形成轉錄泡，RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產生。通過啟動子：第一個核苷酸鍵產生到形成九個核苷酸短鏈的過程。轉錄延伸：RNA聚合酶釋放因子后，核心酶沿DNA模板鏈移動并使新生RNA不斷延伸的過程轉錄終止：RNA延伸到終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂鍵，轉錄泡瓦解，RNA-DNA雜化雙鏈分離，DNA恢復雙鏈，RNA和RNA聚合酶從模板釋放。八、轉錄終止子與翻譯終止密碼的結構特點？（轉錄終止子結構p90）答：轉錄終止子結構：（1）不依賴因子的終止：在終止位點上游一段富含GC二重對稱區，

11、通過轉錄形成RNA容易出現發卡結構，該結構阻止RNA聚合酶的前進，破壞RNA-DNA雜化雙鏈的結構在終止位點上游存在48個A組成的序列，轉錄產物形成不穩定的rUdA區域，上述兩者共同作用，使RNA聚合酶從三元復合物中脫離出來（2）依賴因子的終止：因子為六個相同亞基的聚合物，其能夠催化NTP的水解促使新生成的RNA從三元復合物中脫離出來，從而終止轉錄翻譯終止密碼結構：待定九、什么是RNA編輯？其生物學意義？（p99、p101）答：定義：RNA編輯是某些RNA，特別是mRNA前體的一種加工方式，通過插入刪除或取代一些核苷酸殘基，導致mRNA編碼的遺傳信息發生改變，通過編輯的mRNA序列發生了不同于

12、模板DNA的變化。RNA編輯的機制有兩種：位點特異性脫氨基作用和RNA指導的尿嘧啶插入或刪除。生物學意義：（1）、校正作用：彌補因突變而缺失的遺傳信息。 （2）、調控翻譯：通過構建或除去起始密碼子和終止密碼子來調控翻譯。 （3）、擴充遺傳信息：能使基因產物獲得新的結構功能。第四章一、SD序列（P130）答：原核生物的mRNA上，于翻譯起始密碼AUG上游約10bp處，有一段5AGGAGGU3的富嘌呤區，稱為SD序列。該序列與核糖體30s亞基的16srRNA中的3端一段富嘧啶區互補；通過SD序列，核糖體與mRNA相互作用并結合。二、信號肽(p145)答：定義：在編碼分泌蛋白的基因中，大多5'

13、; 端有一段基因用于編碼疏水性肽段，這一肽段在成熟的分泌蛋白中并不存在，其功能在于引導隨后產生的蛋白質多肽鏈穿過內質網膜進入腔內。其在蛋白質的內質網高爾基體質膜分泌途徑中具有重要作用，并被稱之為信號肽。（來源百度）特征：（1）帶有1015個疏水性氨基酸 （2）靠近N端常有一個或數個帶正電的氨基酸 （3）C端于蛋白酶切割位點附近常有數個極性氨基酸，且離切割位點最近的極性氨基酸常有很短的側鏈三、簡述tRNA 的結構。（P116p117）答：二級結構：“三葉草”結構，含76個堿基，相對分子量為2.5×104 （1）共同點：、含稀有堿基 、3末端均為CCA-OH （2）五個臂：、受體臂：含C

14、CA-OH 、D臂：因含二氫尿嘧啶得名，并含三個可變核苷酸位點 、反密碼子臂：其套索結構中含有三個反密碼子 、TC臂：根據三個核苷酸命名，其中為擬尿嘧啶 、多余臂：為tRNA變化最大的部位。 三級結構：L形折疊。特點：、氫鍵維系 、兩個新增雙螺旋結構：TC臂、受體臂和D臂 、L的兩頭：分別為受體臂和反密碼子臂 、L的轉角處：TC臂和D臂的套索結構 、結構意義：滿足翻譯時核糖體與mRNA的結構相適應。四、簡述核糖體的組成及其功能。（P123p126）答：結構：（1）、由大亞基和小亞基組成，每個亞基都由核糖體蛋白以及rRNA組成 （2）、根據沉降系數不同70S型（原核生物，由50S+30S組成）8

15、0S型（真核生物，由60S+40S組成）（3）、核糖體蛋白：組成活性中心，去除任一蛋白，總體也會失去功能 （4）、rRNA：5S rRNA： 結合50S大亞基、TC臂。 16S rRNA： 結合mRNA、50S大亞基、A（P）位置的tRNA 23S rRNA： 結合tRNAMET 5.8S rRNA： 存在于真核生物中，相當于5S rRNA 18S rRNA： 存在于酵母中，相當于大腸桿菌16S rRNA 28S rRNA： 功能未知 （5）、三個tRNA結合位點：A：結合氨酰tRNA P：結合肽酰tRNA E：移出tRNA tRNA的移動順序：APE 功能：（1）、所有生物體的核糖體結構相近

16、、功能相同參與蛋白質多肽的合成 （2）、大亞基的功能：肽鍵的形成、結合氨酰tRNA、結合肽酰tRNA（3）、小亞基的功能：識別mRNA，識別起始部位、識別密碼子與反密碼子 （4）、核糖體可以根據需要解離為亞基或者合成為顆粒。五、簡述肽鏈合成過程的生物學機制。（P132p136）答：（1）、后續AAtRNA與核糖體結合、起始復合物生成后，AAtRNA與延伸因子EFTu和GTP形成復合物、AAtRNAEFTuGTP復合物進入核糖體A位。同時，GTP水解、通過另一延伸因子EFTs產生GTP，形成EFTuGTP復合物循壞再利用（2）、肽鏈合成、AAtRNA的AA從A位進入P位，與fMETtRNAMET

17、上的AA形成肽鍵、形成肽鍵后的起始tRNA離開P位、A點準備接受新的tRNA（3）、移位：即核糖體沿mRNA的3端方向移動一個密碼子、位于A位的二肽酰tRNA2從A位移動到P位、去氨基tRNA進入E位、mRNA上第三位密碼子對應A位另：1、氨基酸活化 2、肽鏈合成的起始 指核糖體與mRNA及起始氨酰-tRNA結合成起始復合物。分為三步：(1) 核糖體的小亞基與mRNA結合小亞基能識別mRNA上的起始密碼子AUG，并附著在這個部位，形成“小亞基 - mRNA”復合物。(2) 起始氨酰-tRNA結合上去起始氨酰-tRNA與mRNA上的起始密碼子結合，形成了“小亞基 - mRNA - fMet-tR

18、NA”復合物。(3) 大亞基結合上去大亞基與上述復合物結合，形成了起始復合物，即“核糖體 - mRNA - (f)Met-tRNA”復合物。在整個起始過程中，還需有3種蛋白質因子參與，稱起始因子(IF)，即IF1、IF2、IF3。另外，起始過程還消耗高能化合物，即1分子GTP。3、肽鏈的延伸(1) 進位與起始復合物中A位處的密碼子相對應的aa-tRNA進入。此時需消耗1分子GTPGDP。(2) 轉肽P位的fMet-tRNA上的甲酰甲硫氨酰基轉移至A位的aa-tRNA的aa的氨基上，形成肽鍵。催化此反應的酶叫肽基轉移酶，它是核糖體大亞基中的一種酶。此轉肽反應不另外消耗高能化合物，因為活化的氨基酸

19、已具有潛在的能量。(3) 移位核糖體沿著mRNA 3端方向移動一個密碼子的距離，這樣，原來P位空載的tRNA離開了核糖體，原來A位的肽酰-tRNA位于了P位，而A位空了出來。這一步需消耗1分子GTPGDP。通過以上三步，延長了一個氨基酸。在此過程中，還需要一些蛋白質因子的參與，稱為延長因子（EF）。每延伸一個氨基酸，需要消耗 2 分子GTPGDP。（進位和移位）接下來，空著的A位又有新的aa-tRNA進入，通過轉肽移位，又可延長一個aa。重復上述步驟，隨著核糖體從53移動，可使aa按照mRNA上密碼子的要求一個個地對號加入，肽鏈從N端向C端延伸。4、肽鏈合成的終止與釋放 當核糖體由53移動至終

20、止密碼子（UAA、UAG、UGA）時，由于沒有與之相應的tRNA，終止因子RF進入A位。終止因子使肽基轉移酶的活性轉變為水解酶活性(使肽基不再轉移到氨酰tRNA上，而是轉移給水分子)，從而將肽酰tRNA水解。這樣肽鏈被釋放。空載的tRNA也離開核糖體。核糖體的大小亞基解離并離開mRNA。5、新合成多肽鏈的折疊和加工六、蛋白質加工的種類和意義。（P136p140）答：（1）、N端fMET和MET的切除：無論真核、原核細胞，蛋白翻譯之后均要切除N端的甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸（2）、二硫鍵形成：二硫鍵的正確形成對于形成蛋白質天然空間構象具有重要意義（3）、特殊AA的修飾：、磷酸化：蘇氨酸、絲氨酸、酪氨

21、酸（蘇西洛） 、糖基化：、真核細胞蛋白的特征 、于內質網內受糖基化酶的作用 、所有分泌蛋白和膜蛋白均為糖基化蛋白 、甲基化、乙基化、羥基化、羧基化（4）、切除新生肽鏈中的非功能片段：肽類激素或酶的前體大多都要經過此類加工才能成為活性分子七、簡述蛋白質轉運的種類和機制。P142p153答：1、蛋白質轉運分為：翻譯轉運同步機制，翻譯后轉運機制2、幾種主要蛋白質的轉運機制：（1）、分泌蛋白：翻譯轉運同步機制 （2）、細胞器蛋白：翻譯后轉運機制 （3）、膜蛋白：兩者都有3、翻譯轉運同步機制：（1）、核糖體組裝、翻譯開始 （2）、位于N端的信號肽首先被翻譯出來 （3）、SRP與含有信號肽的新生肽鏈以及核

22、糖體及GTP結合，翻譯被中止 （4）、膜上受體DP與SRP結合，形成孔道 （5）、GTP水解，SRP釋放、翻譯繼續進行，邊翻譯邊跨膜 （6）、翻譯結束，信號肽被切除、核糖體解離并恢復到翻譯前起始狀態4、翻譯后轉運：（1）、線粒體轉運：、待轉運多肽由成熟蛋白質和前導肽組成 、轉運需要能量 、先有線粒體外膜上的Tom受體識別Hsp70或MSF等分子伴侶結合的待轉運多肽，再通過Tom和Tim組成的通道進入線粒體腔 、前導肽特點：、堿性氨基酸和羥基氨基酸含量多、有形成兩條螺旋的能力 （2）、葉綠體轉運：葉綠體定位信號肽為兩部分：、決定該蛋白能否進入葉綠體基質 、決定該蛋白能否進入葉綠體類囊體 特征：、

23、活性蛋白水解酶位于葉綠體基質中 、葉綠體膜與葉綠體蛋白前體特異性結合 、葉綠體蛋白前體內可降解序列因植物和蛋白種類不同而不同 （3）、核定位蛋白轉運：真核生物：、NLS（核定位序列）與核轉運因子結合，停留于核孔、依靠GTP水解能量（Ran酶），進入細胞核、亞基解離 原核生物：、新生成蛋白質與分子伴侶SecB結合，形成結合物 、結合物與膜上的SecASecYEG復合物結合 、通過SecA水解ATP將蛋白質分段送出胞外第七、八章一、定義：基因家族。（P282）答：真核細胞中相關基因按功能成套組合，稱為基因家族，同一家族的成員有時緊密排列，組成一個基因簇，但大多分布在同一染色體的不同部位，甚至不同的

24、染色體，有各自不同的表達調控模式。二、簡述操縱子學說。（P237）答：（1）、1961年，由法國科學提出，最初發現的是大腸桿菌的乳糖操縱子。其由三個結構基因Z、Y、A，以及啟動子、控制子和阻遏子等組成，負責調控大腸桿菌的乳糖代謝。（2）、乳糖操縱子結構基因的表達受阻遏蛋白和誘導物的調控，當阻遏蛋白結合到操縱基因之上時，結構基因不產表達，而乳糖（充當誘導物）會與阻遏蛋白結合，使之從操縱基因上脫落下來。這時，操縱基因開啟，結構基因表達，細菌就能分解并利用乳糖了。三、簡述乳糖操縱子的調控模型。（P240）答：（1）、Z、Y、A的基因產物由同一條多順反子mRNA編碼；Z編碼半乳糖苷酶、Y編碼半乳糖苷透

25、過酶、A編碼半乳糖苷乙酰基轉移酶 （2）、啟動區（P）位于阻遏基因（I基因）和操縱區（O區）之間，不能主動進行糖苷酶和糖苷透過酶基因的高效表達 （3）、操縱區為一段短DNA鏈（長約26bp），是阻遏物的結合位點 （4）、阻遏物與操縱區結合后，阻遏lac mRNA的轉錄 （5）、誘導物與阻遏物結合后，改變阻遏物的空間構象，使其不能結合到操縱區，從而激活lac mRNA的表達四、簡述順式作用元件與反式作用因子。（P299）答：（1）、順式作用原件：影響自身基因表達活性的非編碼DNA，如啟動子、增強子、沉默子（2）、反式作用因子：、定義：能夠直接或間接識別或結合在順式作用原件的核心序列，調控靶基因轉

26、錄效率的蛋白質 、常見的反式作用因子：、 HTH結構（螺旋轉折螺旋結構） 、 鋅指結構 、bZIP結構（堿性亮氨酸拉件） 、bHLH結構（堿性螺旋環螺旋結構） 、同源域蛋白 、反式作用因子的唯一結構基礎：轉錄活化域 、轉錄活化域主要結構：、帶負電的螺旋結構 、富含谷氨酰胺的結構 、富含脯氨酸的結構五、DNA 甲基化的方式及其作用。（P292）答：1、方式：通過兩種甲基化酶 （1）日常型甲基化酶：通過甲基化的母鏈，將DNA分子中處于半甲基化狀態的甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化 （2）、從頭合成甲基化酶：無需母鏈，將未甲基化的CpG進行甲基化。 2、常見的DNA甲基化：5mC（5甲基胞嘧啶），N6

27、mA（N6甲基腺嘌呤），7mG（7甲基鳥嘌呤）。 3、作用：通過甲基化關閉某些基因的活性、改變染色體結構、DNA構象、DNA穩定性，以及和蛋白相互作用來達到調控基因表達。六、簡述真核基因轉錄的過程和調控方式。（P296起）答：1、轉錄過程：一般轉錄過程：模板識別、轉錄起始、轉錄延伸、轉錄終止（參見第三章第七問） 真核生物參轉錄機器的組成： （1）、啟動子、核心啟動子 、結構：包括轉錄起始位點以及其上游3525bp處的TATA盒 、作用：確定轉錄起始位點，產生基礎水平轉錄 、上游啟動原件、結構：包括位于70bp的CAAT盒以及GC盒等 、作用：提高轉錄效率 （2）、轉錄模板：從轉錄起始點到RNA

28、聚合酶轉錄終止處的全部DNA序列。 （3）、RNA聚合酶 （4）、RNA聚合酶基礎轉錄所需的蛋白質因子（TF）： 、TFD、B、F形成初級復合物 、TFH、E加入后形成完整轉錄復合物 、加入TFA可提高轉錄效率 、轉錄時TFD、A滯留在轉錄起始位點上。 2、調控方式：大多數通過順式作用原件和反式作用因子相互作用調控 （1）、順式作用原件：啟動子：（見上） 增強子：（定義、功能特點見第三章） 沉默子：為參與基因表達負調控的一種元件，其DNA序列被調控蛋白結合后阻斷了轉錄起始復合物的形成或活化，使基因表達活性關閉。（2）、反式作用因子：（見上）分子生物學考試重點后半部分一、基因工程答：在體外將核酸

29、分子插入載體分子中，使之進入原先不含此類分子的寄主細胞中，并使之進行持續穩定的繁殖和表達的技術。其與其他技術最顯著的區別是，基因工程技術跨越了天然生物屏障，能將來自任何生物的基因置于與之毫無親緣關系的寄主細胞中。二、限制性核酸內切酶答：1、定義：能識別DNA中特定的堿基序列，并從該位點切開DNA分子的酶稱。其能夠識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA分子失去活性，并限制外來噬菌體的繁殖。2、分類：（1）限制性核酸內切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在識別位點附近的核苷酸切割DNA分子，但切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。代表酶：EcoK EcoB。（2）、限制性核酸內切酶：能夠識別

30、專一的核苷酸順序，并且在該順序內固定位置切割DNA分子，識別的專一順序是：回文對稱順序。代表酶：EcoR。（3）、限制性核酸內切酶：能夠識別專一的核苷酸順序，但所識別的順序并非回文對稱順序，能夠在所識別的核苷酸順序外專一切割DNA分子。3、反應過程：（1）、加DNA（2）、加Buffer（3）、加酶（4）、37一小時或過夜（5）、停止反應，65加熱，加EDTA或苯酚4、注意事項：（1）、使用濃縮限制性核酸內切酶時以1×限制酶緩沖液稀釋 （2）、每次取酶均應更換無菌吸頭，操作要快，操作完立刻放回20冰箱內 （3）、盡量減小反應體積，但酶的體積最多不超過總體積的10% （4）、切割大量D

31、NA時，延長作用時間可以減少所需的酶，反應時可取少量酶，行微量凝膠電泳來檢測反應 （5）、注意星號酶切活力：核酸內切酶在一些特殊情況下，對底物DNA特異性降低，將與特定DNA序列不同的堿基切斷三、基因組DNA文庫和cDNA文庫答：1、基因組DNA文庫 （1）、概念：將某種生物細胞的基因組DNA切成適當大小，分別與載體分子組合，并導入微生物細胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克隆（理論上每個序列至少有一份代表），這樣的克隆片段的匯總稱為基因組的DNA文庫 （2）、應用： 、分離特定DNA片段 、分析特定DNA結構 、研究基因的表達調控 、構建全基因組物理圖譜、進行全基因組測序 2、c

32、DNA文庫：指通過一系列酶的催化作用，將總體ploy（A）mRNA轉變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當的載體分子上，轉化大腸桿菌的寄主菌株細胞，構成包含所有基因組編碼序列的cDNA文庫四、基因克隆的主要過程。答：包含目的基因的分離和鑒定兩個主要步驟。簡而言之：切、連、轉、篩。（1）選擇用于克隆的DNA材料，并將其片段化。（2）在體外，將外源DNA分子片段與合適的載體分子進行連接。（3）將人工重組DNA分子導入能使其正常復制的宿主細胞中進行增值。（4）重組分子轉化子克隆的選擇或篩選。五、用于分子克隆的載體有哪些特點？答：1、具有高度自主復制和繁殖的能力2、能較容易地進入宿主細胞，并且在宿主細胞內

33、具有較高的拷貝數3、具有合適的限制性酶切位點，可以接納外源性DNA片段的插入，并且不因含有外源性片段而改變本身的基本特性4、具有篩選位點，和識識別位點；以進行篩選和識別片段是否插入六、用于分子克隆的載體有哪些種類？常用的有哪些？答：1、常用載體種類：質粒、噬菌體、病毒2、常用的哪些：（1）、質粒：pSC101、pBR332、pUC、pGEMZ、柯斯質粒 （2）、噬菌體：噬菌體七、簡述核酸的凝膠電泳的基本原理答：1、概念：核酸的凝膠電泳就是以按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術 2、遷移率：在電場下，電泳分子向適當電極的移動速度稱，其與電場強度和電泳分子所帶的凈電荷成正比，和分子量大小成反比 3

34、、基本原理：（1）、生理條件下，RNA和DNA分子為多聚陰離子，其在電場中向正電極遷移 （2）、由于糖磷酸骨架在結構上的重復性，相等數量的DNA分子片段的凈電荷幾乎相同，其在電場中的遷移率也相同 （3）、在一定強度的電場下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構型八、簡述攜帶目的基因的重組子的篩選和鑒定。答：1、根據重組載體的標志作為篩選（1）、抗藥性篩選：、利用載體DNA上組裝的抗藥性選擇標記進行篩選的方法。、常用篩選劑：氨芐青霉素；氯霉素；卡那霉素；四環素；鏈霉素。、重組質粒DNA攜帶特定的抗藥性基因，轉化后賦予載體的受體菌在含有相應抗生素的培養基上正常生長，而不含此載體的受體菌不

35、能存活。（2）、插入失活篩選法：外源目的基因的插入，會導致如抗藥性基因的失活。將轉化后的細胞分別培養在含有抗生素的培養基中，便可檢出轉化子細胞。（3）、插入表達篩選法：外源目的基因插入特定載體后，能激活用于篩選操作的標記基因的表達，由此進行轉化子的篩選。（4）、顯色反應篩選法：如藍白斑試驗：lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現-互補。由-互補而產生的細菌在誘導劑作用下，在生色底物存在時產生藍色菌落。當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，導致產生無-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。2、限制性核酸內切酶圖譜分析：將重組子限制酶切

36、位點圖譜與空載體圖譜對比，根據各種酶切所得DNA片段的大小及變化，可推測有無插入，并確定插入位置。 3、利用PCR方法篩選：利用合適的引物，從初選出來的陽性克隆中提取的質粒為模板進行PCR反應，通過對PCR產物的電泳分析來篩選。4、DNA序列測定 ：對重組子測序。九、簡述Northern Blot的基本原理。答：1、原理：RNA經過變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉移到硝酸纖維膜或尼龍膜上，經過雜交，分析mRNA的大小及含量。2、應用：半定量分析mRNA的含量；確定mRNA分子的大小。3、方法：提取組織細胞總RNARNA定量變性膠電泳轉膜干膜預雜交雜交洗膜壓片洗片圖像分析十、核酸探針的主要標記法及注

37、意條件。答：1、標記物應具備的條件： （1）、標記后的探針的分子結構要盡可能與原來的分子結構相同，不影響其堿基配對特異性，不影響探針分子的主要理化特性，尤其是雜交特性。 （2）、標記探針的檢測方法應簡便省時、準確可靠、重復性好、靈敏度高、穩定性好、 環境污染少、價廉2、主要標記法：（1）、切口平移：利用DNA聚合酶的特點（2）、隨機引物延伸法：人工合成的6個核苷酸殘基的寡核苷酸片段，4096種排列順序， klenow大片段作為聚合酶（3）、末端標記法十一、原位分子雜交技術的基本原理。答：（來源百度）利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色

38、體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。必須具備3個重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物。 （老師課件）是將核酸分子雜交技術與組織細胞化學和免疫組織化學技術結合，在組織細胞原位顯示某種特定基因，以及觀察mRNA表達、定位及其變化規律的一種技術，可進行組織細胞定位。十二、簡述PCR技術的原理、特點及過程。答：1、原理：PCR技術實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。 （1）、變性：通過加熱使DNA雙螺旋

39、的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA （2）、模板與引物退火：當溫度突然降低時，由于模板分子結構較引物要復雜得多，而且反應體系中引物DNA的量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少。 （3）、引物延伸：在DNA聚合酶和dNTPmix及Mg2+存在條件下，53的DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。（4）、小結：高溫變性低溫退火恒溫延伸的過程就是一個PCR循環。延伸產物經第二個循環變性后，又作為模板再合成新的DNA。依此類推，每一循環后的模板均比前一個循環增加1倍。因此，經過n個循環后，產量為2n拷貝。而實際上PCR的平均擴增率為75%。2、特點：高度敏感性、高度特異性、性操作簡便、快速、適用樣品廣泛、有一定程度的單核苷酸錯誤摻入3、實驗過程（實驗步驟）：（1）、首先：將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（>94）環境下加熱1分鐘，使雙鏈D