1、TA29-Barnase 轉基因雄性不育芥菜的獲得及豌豆花藥特異啟動子 PsEND1功能分析載體構建雄性不育作為雜種一代生產最為經濟、有效的方法在水稻、 玉米、油菜以及部分蔬菜作物中廣泛應用。 由于具有育種實用價值的天然雄性不育資源較為稀缺,同時不育資源在不同作物中分布不均勻, 導致一些農作物雜種優勢利用發展緩慢。針對該情況 , 育種家將解決問題的思路轉向通過基因工程創制雄性不育。目前 , 利用基因工程手段己經在多種植物中獲得了雄性不育系, 并在油菜、玉米、菊苣等作物中成功商業化應用。芥菜是我國的特產蔬菜之一, 雖然近年來利用細胞質雄性不育在芥菜雜種優勢育種上取得了一定的進展, 但如何發掘、創

2、造優良的芥菜雄性不育材料仍是當前芥菜雄性不育研究的重要內容之一。同時, 為保證基因工程雄性不育系育性穩定性, 獲得一個時空表達嚴謹的雄性器官特異啟動子是關鍵要素之一。PsEND1啟動子 (Pisum sativum ENDOTHECIUM1)是一個長度為2.7Kb 的豌豆花藥特異啟動子 , 該啟動子早期在花藥原基細胞表達, 之后便嚴格限制在雄蕊原基的表皮、結締組織、藥室內壁和中層細胞等細胞層表達。相對基因工程雄性不育常用的絨氈層啟動子 , 該啟動子在花藥發育的開始驅動不育基因的表達, 在小孢子母細胞分化之前阻止小孢子的發生, 最終導致花粉敗育。 因此 , 該啟動子控制的雄性不育可能敗育更為徹底

3、。但目前 , 有關該啟動子的功能區域尚未有研究報道, 同時該啟動子序列太長也不利于雄性不育基因的遺傳操作。針對上述情況, 本論文將煙草絨氈層TA29啟動子驅動下的Barnase 基因通過農桿菌介導法導入“渝豐”榨菜, 獲得了敗育徹底的雄性不育植株 , 拓寬芥菜雄性不育資源。 同時 , 根據啟動子的順式作用元件的分布情況設計引物 , 對全長 2.7Kb 的 PsENDl啟動子進行 5端缺失 , 分別與 GUS報告基因和 Barnase 基因構建融合表達載體 , 轉化農桿菌 EHA105,并分別轉化擬南芥和煙草 , 獲得的主要結果如下： 1. TA29-Barnase 轉基因雄性不育芥菜植株的獲得

4、 (1) 將 TA29-Barnase 用農桿菌介導轉化“渝豐”榨菜下胚軸, 通過PPT(phosphinothricin,膦絲菌素 ) 的多輪篩選獲得轉基因芥菜植株。(2) TA29-Barnase 轉基因芥菜植株的分子檢測提取轉基因植株 DNA用TA29-1+BN-2引物進行 PCR擴增 , 結果在 5 株轉基因植株中擴增出預期約630bp大小的 DNA片段 , 表明外源目的基因已整合到芥菜植物基因組中。(3) 轉基因芥菜植株的花器官形態轉基因芥菜植株與野生型芥菜植株形態之間無明顯差異, 但開花時轉基因植株與野生型植株相比花朵偏小, 并伴隨花瓣較小、雌蕊短且粗、雄蕊短縮的現象 , 同時花藥

5、瘦小、 干癟、無花粉囊及花粉。 (4) 轉基因芥菜植株的花藥發育的細胞學觀察通過石蠟切片和顯微觀察, 轉基因植株的花藥絨氈層細胞提前降解 , 不能產生有活性的花粉 , 花藥敗育。(5) 轉基因芥菜植株的結實性轉基因植株開花后 , 自交花朵的果莢基本不能膨大 , 部分脫落 , 無種子形成 , 用野生型植株花粉授粉后 , 基本均能結實 , 但與野生型植株相比果莢較短 , 不飽滿 , 且種子數少。 2. PsENDl啟動子的功能分析載體構建 (1) 提取豌豆 DNA,利用引物 PSE1+PSE2擴增獲得預期長度為 2.7Kb 的 PsEND1啟動子 , 測序分析顯示獲得了正確的PsEND1啟動子。(

6、2) 對 PsEND1啟動子進行 5端缺失 ,PCR獲得五條不同長度的5端缺失啟動子。分別以 PS-2+PS-7; PS-3+PS-7; PS-4+PS-7; PS-5+PS-7; PS-6+PS-7為引物 ,PsENDl 為模板 ,pfu高保真酶擴增出5 個不同長度的啟動子片段, 將擴增出預期目的片斷插入PSK,測序結果正確 , 依次命名為 PSKPS、PSKPS-3、PSKPS-4PSKPS、-5PSKPS-6。 (3) 不同長度 PsENDl5端缺失啟動子驅動Barnase基因表達載體的構建以BN-F+BR-R為引物 ,PCABARABN-10為模板 ,pfu 高保真酶擴增 Barnas

7、e 及下游的 Nos 終止子和 Bastar 基因 ,PCR產物用 NcoI+EcoRI 酶切后插入中間載體 PB1525后進行測序分析。將 PSKPS-2(3、4、5、6) 上的不同長度啟動子酶切下來替換中間載體上的 35S-35S 啟動子 , 最后將構好的不同長度的PsENDl缺失啟動子及下游的Barnase 基因片段用 Hind+EcoRI 酶切后插入PCABarSN/SCG載體相應位點獲得對應的植物表達載體PCABarPS-2Barnase、PCABarPS-3Barnase、 PCABarPS-4Barnases、 PCABarPS-5Barnase、PCABarPS-6Barnase。上述載體經 PCR、酶切檢測正確 , 用液氮凍融法轉入農桿菌EHA105。(4) 不同長度 PsENDl5端缺失啟動子驅動GUS報告基因表達載體的構建將PBIIN2-1/GUS載體中的 GUS基因及下游的 Nos終止子用 Ncol+EcoR1替換上述載體中的Barnase基因 , 獲得 PCABarPS-2Gus、PCABarPS-3Gus、PCABarPS-4Gus、 PCABarPS-5Gus、PCABarPS-6Gus表達載體。上述載體經 PCR、酶切檢測均正確 , 用液氮凍融法轉入農桿菌 EHA105。(5) 將 P