1、PURB在氨基酸調節BMECs乳合成中的作用和分子機理哺乳動物乳腺組織在哺育下一代時分泌乳汁為其成長提供營養以及免疫保護 , 乳汁中的主要成分包括乳蛋白、 乳脂肪、乳糖等 , 牛乳也是人類生活中必不可少的優質食品。 乳合成相關的信號轉導通路、 調控乳合成的關鍵信號分子及其作用機制是畜牧學亦是生命科學研究的重要內容。PURB是 Pur 蛋白家族中成員 ,Pur 家族蛋白可以形成同型和異型復合物, 并且特異性地以高親和力結合富含嘌呤的ssDNA(有義或反義 ) 或 RNA。它們優先結合含有 GGN(N不是 G)重復序列。本研究前期發現當蛋氨酸(Met) 刺激時牛乳腺上皮細胞 (BMECs)PURB

2、表達量顯著增加 , 提示 PURB作為轉錄因子可能對BMECs的乳的合成起調控作用。目前,國際上有關 PURB的功能和作用機制的研究較少, 尚無研究揭示 PURB對 BMEC乳合成是否發揮作用。本實驗擬揭示 PURB在氨基酸促進 BMECs乳蛋白和乳脂肪合成中的作用及其分子機理。本研究通過組織塊法培養和純化BMECs,得到的原代 BMECs進行傳代培養 ,-80 凍存備用。倒置顯微鏡下觀察細胞形態和生長速度, 免疫熒光 (IF) 法鑒定細胞的純度 :檢測細胞中 - 酪蛋白 ( -casein) 和角蛋白 18(Cytokeratin 18)的表達。在培養液中添加 0.6 mmol/L Met或

3、 0.6 mmol/L Leu,qRT-PCR 和 western blotting實驗結果表明 -casein 和 -casein表達量顯著提高。脂滴實驗結果與甘油三酯(TG) 檢測實驗表明 ,Met 和 Leu 能夠顯著促進 BMECs乳脂肪的合成。通過以上實驗成功地建立了氨基酸調節乳合成的體外細胞培養模型。qRT-PCR和 western blotting結果表明 PURB蛋白和 mRNA的表達量在 Met和 Leu 作用時顯著上升。IF 檢測 PURB的亞細胞定位 , 顯示 PURB定位在胞核中 ,Met 、Leu 處理增強 PURB在胞核中的定位。這些結果表明 ,Met 和 Leu

4、能夠顯著促進 BMECs中 PURB的表達和核定位 , 提示在 Met 和 Leu 上調乳蛋白和乳脂肪合成的過程中,PURB可能是一個重要的調節因子。利用重組質粒和siRNA 對 PURB基因進行過表達和干擾。PURB基因過表達時 ,PURB、-casein和 -casein表達量顯著提高 ,TG 分泌和脂滴的合成顯著提高 ,mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平也顯著提高 ;PURB基因干擾時 ,PURB、-casein及 -casein 表達量顯著降低 ,TG 分泌和脂滴的合成顯著降低 ,mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平也顯著降低。 以上研究結果表明 ,PURB具有正向調節

5、mTOR和 SREBP-1c信號分子從而促進乳蛋白和乳脂肪合成的作用。為了探究 PURB接受 Met 和 Leu 刺激從而調節乳合成的分子機制, 應用 PI3K抑制劑沃曼青 (wortmannin) 抑制 PI3K 信號通路。 Western blotting分析表明PI3K 抑制完全阻斷了2 種氨基酸對 PURB表達的促進作用。結果表明 Met 和 Leu 通過 PI3K 途徑促進 PURB蛋白表達。為進一步探究 PURB是否介導 Met 和 Leu 調節 mTOR和 SREBP-1c信號分子 , 細胞添加 Met 或 Leu 時同時轉染 PURB siRNA。Western blottin

6、g分析表明 PI3K 抑制完全阻斷了兩種氨基酸對mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平的促進作用。結果表明PURB介導 Met 和 Leu 調節 mTOR和 SREBP-1c信號途徑。采用染色質免疫共沉淀 (ChIP)-PCR 和 ChIP-qPCR鑒定 PURB與 mTOR、SREBP-1c基因的啟動子 (-1-2 000bp)可能發生結合的位點。結果發現PURB與mTOR、SREBP-1c基因的啟動子各存在一個結合位點。ChIP-qPCR結果顯示 ,Met 和 Leu 刺激促進 PURB與靶基因啟動子的結合。 PURB基因過表達和干擾發現PURB正向調節 mTOR和 SREBP-1c的 mRNA水平。這些實驗結果表明Met 和 Leu 刺激 PURB表達并促進與 PURB與 mTOR、SREBP-1c的基因啟動子結合 , 啟動基因轉錄。已有研究提示PURB在基因轉錄中起著關鍵作用 , 但與許多其他轉錄因子相比, 國際上發表的結果較少。本研究發現在 BMECs中,PURB是牛乳腺細胞中乳蛋白和乳脂肪合成的正向調控因子。 PURB位于細胞核 , 氨基酸 (Met 和 Leu) 通過 PI3K 信號途徑促進 PURB表達。PURB可以與 mTOR和 SREBP-1c基因啟動子結合促進其轉錄,Met 和 Leu 刺激這種結合。 PURB介導 Met 和 L