1、高壓冷凍及冷凍替代技術電鏡制樣高壓冷凍及冷凍替代技術電鏡制樣，是用高壓冷凍儀把生物樣品中的水快速冷凍，形成玻璃化的冰，從而保護生物樣品的超微結構不被破壞。然后將生物樣品轉移到冷凍替代儀中，經過低溫脫水，化學固定，包埋劑滲透和聚合，然后切片和染色，最后透射電鏡觀察。與常規化學固定制樣相比具有顯著的優勢，能更真實的保存生物樣品的超微結構。目前細胞分析技術平臺擁有高壓冷凍儀Leica EM PACT2（如圖一）和冷凍替代儀Leica EM AFS2（如圖二）。圖二、冷凍替代儀Leica EM AFS2圖一、高壓冷凍儀Leica EM PACT2該制樣方法在應用過程中，生物樣品中的水極易形成冰晶（如圖

2、三），破壞超微結構。為了降低冰晶產生的可能性，我們在上樣和冷凍替代上做了以下改進：一、上樣除了不能有氣泡，還要保證加入填充液（1-Hexadecene）的液面要略高于Carrier。以往經驗要求填充液液面恰好與Carrier水平，一般很難做到，若把握不好液面略低于Carrier，就會形成空腔，導致高壓冷凍的失敗。若略高于Carrier，就不會有這樣的問題，降低了冰晶產生的可能性。二、高壓冷凍之后，樣品轉移到裝有冷凍替代液的凍存管里，然后轉移到冷凍替代中，整個過程樣品都有液氮保護，防止由于樣品回溫導致冰晶的產生。三、樣品進入冷凍替代后，要用預冷的解剖針沿著樣品劃個圈，1-Hexadecene低溫

3、下可能會阻止冷凍替代液接觸樣品，劃圈之后樣品更有利于冷凍替代液與樣品接觸。四、根據冷凍替代儀樣品腔的大小，我們自己設計一款凍存管架（如圖四）。與之前管架相比，這款凍存管架有以下特點：1、各個腔室彼此獨立，受環境熱空氣影響小；2、鋁制管架，溫度調控更快更準確。3、操作更加便捷。NMi圖四、凍存管管架實物圖圖三、冰晶破壞的細胞以細胞和小鼠肝臟組織為例，高壓冷凍和冷凍替代技術制樣，得到細胞和小鼠肝臟超微結構（如圖五和圖六）。樣品制備具體操作如下：圖六、小鼠肝臟細胞中的線粒體圖五、Hela細胞中的高爾基體1 取樣1.1 懸浮細胞：取適量的細胞懸浮液，低速離心成細胞團，去上清，細胞團呈米糊狀，用移液槍取

4、適量細胞，填滿Carrier，加入適量冷凍保護液1-Hexadecene，濾紙吸取多余液體，使冷凍保護液液面略高于Carrier。1.2 小鼠肝臟：從活體上取出的組織，先用鋒利的刀片在低溫下切成盡可能薄片狀，從中挑選合適的部分切下來，然后裝入Carrier，加入適量冷凍保護液1-Hexadecene，濾紙吸取多余液體，使冷凍保護液液面略高于Carrier。2高壓冷凍高壓冷凍儀在使用前，要先做一些準備工作：加入足夠的液氮和壓力液甲基環己烷，然后用空載的carrier高壓冷凍三次，保證高壓冷凍儀在最佳工作狀態。2.1 將上述裝有樣品的carrier快速安置到高壓冷凍儀，準備高壓冷凍。2.2高壓冷凍

5、樣品，迅速把樣品冷凍，并做好記錄。通過高壓冷凍儀冷凍樣品后產生的冷凍速度和壓力變化曲線，以此選擇冷凍效果較好的樣品繼續下面實驗。2.3轉移樣品，首先把現配的替代液1%鋨酸（0.5g鋨酸溶于50mL丙酮）分裝到2mL凍存管中，迅速放入液氮冷凍備用，冷凍過程中保持冷凍管直立。與此同時，冷凍替代儀加滿液氮，將自制的凍存管架放入樣品腔，預冷至-100。用預冷的鑷子，在液氮下將Carrier分別裝入凍存管，凍存管蓋不宜擰的過緊，然后迅速轉移到冷凍替代儀樣品腔室的凍存管架里。3 冷凍替代冷凍替代-9012h后，用預冷的解剖針沿樣品劃一圈，便于替代液接觸樣品，加速替代。步驟溫度時間1-100 -904h2-

6、9048h3-90 -608h4-608h5-60 -304h6-308h7-30 -202h8-208h9-20 42h1041h溫度達到4后，用4的丙酮浸洗樣品3次，每次15分鐘。此過程中，會有部分樣品與Carrier分離，若還有沒分離的可以用解剖針將樣品從Carrier中剝離。4 滲透包埋分別用以下滲透液滲透。步驟滲透液濃度時間1Epon812/丙酮1:11.5-2h2Epon812/丙酮3:16-12h3Epon812100%1h4Epon812100%8h5Epon812100%1h然后將樣品轉移至包埋槽，60烘箱聚合48h。5 超薄切片與染色將聚合的包埋塊用超薄切片機切出70 nm的薄片，用鍍膜載網撈片，并鉛鈾染色。6 電鏡觀察在透射電鏡下觀察，找到感興趣區域，放大拍照。注意事項：1. 取樣時，動作要盡可能快，避免生物樣品發生自溶破壞超微結構。2. 上樣過