1、Genetic engineering重組DNA技術的發展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年 美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫學上重要的藥物。1980年 開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉分子生物學常用技術原理 相關概念相關概念DNA克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因載體基因載體 基本原理基本原理 重組重組DNA技術應用技術應用本節主要內容本節主要內容克隆

2、克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無，即無性繁殖。性繁殖。技術水平：分子克隆技術水平：分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 細胞克隆細胞克隆個體克隆（動物或植物）個體克隆（動物或植物）生物技術工程生物技術工程: 基因工程、蛋白質工程、基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等酶工程、細胞工程等目的目的 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）基因工程(

3、genetic engineering) 利用基因克隆方法獲取目的基因并使克隆的基因表達為蛋白質或多肽產物或定向改造細胞乃至生物個體的特征及相關的工作稱基因工程，、 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉錄酶逆轉錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉移酶末端轉移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶多核甘酸激酶等多核甘酸激酶等重組重組DNA技術中常用的工具酶技術中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷

4、酸二羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚聚合、合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第第二鏈合成，雙鏈二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標記等末端標記等反轉錄酶反轉錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行

5、填補，標記或進行填補，標記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶末端轉移酶在在3 羥基末端進行同質多聚物加尾羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基（一）限制性核酸內切酶（一）限制性核酸內切酶1、概念、概念限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)是識別是識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點或其周并在識別位點或其周圍切割雙鏈圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGC

6、CTAGGATCC GBam H第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。用羅馬數字表示發現的先后次序。Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結構回文結構(palindrome) 切口切口 ：平端切口：平端切口、粘端切口粘端切口3、限制性核酸內

7、切酶的識別和切割位點、限制性核酸內切酶的識別和切割位點Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口5 G AATTC.33 CTTAA G.55G AATTC.33CTTAA G55CTGCA G 3 3 G ACGTC55CTGCA G33G ACGTC5作用作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統，限制外源飾系統，限制外源DNA， 保護自身保護自身DNA。*分類分類、（基因工程技術中常用（基因工程技術中常用型）型）（二）、其它工具酶（二）、其它工具酶1、DN

8、A連接酶連接酶、三、載體三、載體定義定義為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分分子。子。常用載體常用載體質粒質粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA粘粒粘粒DNA克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。設計的載體稱為克隆載體。表達載體表達載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。多肽鏈而特意設計的載體

9、稱為表達載體。三、載體三、載體此處是標題wanghome表表 達達 載載 體體載體的選擇標準載體的選擇標準 能自主復制； 具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； 分子量小，以容納較大的外源DNA。（一）、（一）、 質粒質粒 (plasmid)特點特點: :能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 噬菌體噬菌體DNA改造系統改造系統 gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克隆）克隆）EMBL

10、系列（置換型，適用基因組克隆系列（置換型，適用基因組克隆）. 噬菌體噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統（含改造系統（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列（三）（三） 粘性質粒粘性質粒(cosmid)其它：如其它：如酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細菌人工染色體細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)用動物病毒用動物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）重組重組DNA(r

11、ecombinant DNA) -分子克隆分子克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或 DNA克隆) 。 四、重組四、重組DNA技術的基本原理技術的基本原理基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導入受體菌導入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建克隆載體的選擇和構建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基

12、因的表達 以以 質質 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程目目 錄錄（一）目的基因的制備（一）目的基因的制備1. 化學合成法化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列 。2.基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) * 化學合成法獲取目的基因化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列序列組織或細

13、胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉化菌含重組分子的轉化菌限制性內切酶限制性內切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉化細胞內存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合* 從基因組從基因組DNA文文庫獲取目的基因庫獲取目的基因限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外

14、包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫目目 錄錄mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉錄酶反轉錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復制復制* 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉錄酶逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T目目 錄錄（二）目的基因與載體的連接（二）目的基因與載體的連接1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)

15、同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接Bam H切割反應切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連

16、目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接目目 錄錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。

17、目目 錄錄 2. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉移酶在末端轉移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。制造出粘性末端，再進行粘端連接。3. 平端連接平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平適用于：限制性內切酶切割產生的平端端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內切酶限制性內切酶限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連目目 錄錄5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3

18、 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉移酶末端轉移酶+ dATP末端轉移酶末端轉移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體目目 錄錄4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接除產生粘性末端，而進行粘端連接。 人工接頭及其應

19、用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態處于感受態(competent) 導入方式導入方式轉化轉化 (transformation)轉染轉染 (transfection)感染感染 (infection)（三）重組（三）重組DNA導入受體菌導入受體菌（四）重組體的篩選和鑒定（四）重組體的篩選和鑒定 1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標記選擇（遺傳學方法）抗藥性標記選擇（遺傳學方法）(2) 標志補救標志補救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子

20、雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡 2. 免疫學方法免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等如免疫化學方法及酶免檢測分析等 3. 基因重組與表達技術 基因來源基因來源: 酶切片段酶切片段 mRNA cDNA (RT-PCR) PCR產物產物 化學合成：單鏈寡核苷酸化學合成：單鏈寡核苷酸互補寡核苷酸鏈退火時互補寡核苷酸鏈退火時,注意溫度變化要非常的緩慢注意溫度變化要非常的緩慢,有利有利于寡核苷鏈完全正確互補成雙鏈于寡核苷鏈完全正確互補成雙鏈 (95 自然冷卻至室溫自然冷卻至室溫)克隆重組克隆重組克隆載體的選擇克隆載體的選擇 抗生素雙抗性載體：抗生素雙抗性載體： 互補篩選互補篩選: p

21、UC19 pBluecript II 基因與載體的連接基因與載體的連接 外源片段與載體的比例：平端外源片段與載體的比例：平端 (3-10):1，粘端，粘端 1:1轉化宿主轉化宿主:JM109 DH5 重組子的篩選與鑒定重組子的篩選與鑒定抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet重組子的篩選與鑒重組子的篩選與鑒定定AmN2H 宿主宿主菌菌重組子的篩選與鑒定藍白篩選重組子的篩選與鑒定藍白篩選原理原理原理原理藍白斑篩選藍白斑篩選 互補：互補：laz編碼的編碼的肽鏈肽鏈；半乳糖苷酶突變體半乳糖苷酶突變體-互補（互補（-complementation）：）：在在T-vector或或 PUC質粒序列中，插入

22、了質粒序列中，插入了lac啟動子啟動子-操縱操縱子基因序列以及編碼子基因序列以及編碼-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N-端端145個氨基酸的個氨基酸的核苷酸序列（又稱核苷酸序列（又稱-肽）；肽）；這類載體對應的宿主菌（如這類載體對應的宿主菌（如JM、DH5系列）系列）-半乳半乳糖苷酶基因失去了編碼糖苷酶基因失去了編碼-肽堿基序列肽堿基序列只有當這類載體引入到宿主菌后，載體上的只有當這類載體引入到宿主菌后，載體上的-半乳糖半乳糖苷酶苷酶N-端片端才能與宿主菌的缺陷端片端才能與宿主菌的缺陷-半乳糖苷酶互補，半乳糖苷酶互補，產生有活性的產生有活性的-半乳糖苷酶，這種作用稱為半乳糖苷酶，這種作用稱為-互補。互補

23、。重組子鑒定挑分離良好，大小中等的菌挑分離良好，大小中等的菌落培養落培養5ml菌液菌液小量制備質粒小量制備質粒酶切，瓊脂糖凝膠電酶切，瓊脂糖凝膠電泳泳測序測序基因表達 選擇表達系統 原核系統 真核酵母 動物細胞 植物細胞 構建表達載體 重組克隆載體 表達載體 目的基因亞克隆目的基因亞克隆 正確的正確的ORF 導入細胞導入細胞: 化學方法（化學方法（CaCl2)、電轉化、電轉化 、顯微注射、顯微注射、 基因槍基因槍 外源基因表達外源基因表達: 化學誘導、溫度誘導化學誘導、溫度誘導 基因表達檢測基因表達檢測: SDS-PAGE 、RT-PCR、Western Blot亞克隆亞克隆一、定義一、定義

24、將克隆將克隆DNA片段從一個載體轉移到另一個載體片段從一個載體轉移到另一個載體二、應用二、應用 研究克隆研究克隆DNA片段其中的一段序列克隆片段其中的一段序列克隆 DNA片段的表達片段的表達( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇目目 錄錄組氨酸缺陷組氨酸缺陷型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養基的培養基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進組氨酸合成促進組氨酸合成 DNADNA重組體重組體標志補救標志補救 互補互補目目 錄錄 互互補補的的檢檢測測目目 錄錄原原位位雜雜交交目目 錄錄Southern印跡印跡目目 錄錄雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋

25、白的克隆和檢出目目 錄錄重組重組DNADNA技術操作過程可形象歸納為技術操作過程可形象歸納為 小小 結結分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉轉轉入受體菌轉入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術操作的主要步驟技術操作的主要步驟載體載體質粒質粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產物產物限制酶消化限制酶消化開環載體開環載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉化轉化體外包裝，轉染體外包裝，轉染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選

26、表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交目目 錄錄表達體系的建立表達體系的建立表達載體的構建表達載體的構建受體細胞的建立受體細胞的建立表達產物的分離純化表達產物的分離純化（五）克隆基因的表達（五）克隆基因的表達1. 原核表達體系原核表達體系 （E.coli表達體系最為常用）表達體系最為常用）標準：標準：選擇標志選擇標志強啟動子強啟動子 翻譯調控序列翻譯調控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足表達體系的不足 不宜表達真核基因組不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體表達的蛋白質常形成不溶性

27、包涵體 (inclusion body) 很難表達大量可溶性蛋白很難表達大量可溶性蛋白大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌的表達和分泌目目 錄錄優點：優點：可表達克隆的可表達克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區域積累表達產物分區域積累缺點：缺點：操作技術難、費時、經濟操作技術難、費時、經濟轉染轉染 將表達載體導入真核細胞的過程將表達載體導入真核細胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉染磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染葡聚糖介導轉染電穿孔電穿孔 脂質體轉染脂質體轉染 顯微注射顯微注射 2. 真核表達體系真核表達體系 酵母、昆蟲、乳類動

28、物細胞酵母、昆蟲、乳類動物細胞表達載體表達載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜目目 錄錄目目 錄錄 重組重組DNA醫藥產品醫藥產品產產 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進凝血促進凝血顆粒細胞顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成剌激白細胞生成促紅細胞生成素促紅細胞生成素剌激白細胞生成剌激白細胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細胞生長與分化刺激細胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些

29、腫瘤白細胞介素白細胞介素激活、剌激各類白細胞激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療向治療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預防乙肝預防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂預防霍亂基因診斷基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子生利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。或插入等突變。（

30、三）基因診斷（三）基因診斷基本過程基本過程區分或鑒定區分或鑒定DNA的異常的異常分離、擴增待測的分離、擴增待測的DNA片斷片斷標準標準. 能正確擴增靶基因；能正確擴增靶基因；. 能準確區分單個堿基的差別；能準確區分單個堿基的差別；. 本底或噪聲低，不干擾本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定的鑒定;. 便于完全自動化操作，適合大面積、便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查大人群普查。（四）基因治療（四）基因治療定義定義基因治療基因治療(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的

31、。其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式方式體細胞基因治療體細胞基因治療 (somatic cell gene therapy)性細胞基因治療性細胞基因治療 (germ line gene therapy)分子生物學常用技術 凝膠電泳() 分子雜交() 聚合酶鏈反應(PCR)技術() DNA的物理圖譜 DNA序列測定 基因芯片第一節 凝膠電泳(gel electrophoresis) 電泳概念 基本原理 Q 6r : 遷移率 Q : 電荷量 r : 粒子半徑（分子量） : 介質粘度 電泳的用途分離鑒定純度測定分子量 凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳() 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （一）分離核酸原理 電荷

32、效應 分子篩效應 分子構象瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis) 分離核酸原理 操作要點 應用范圍1. 電荷效應 核酸是兩性電解質 pH = 3.5 , 正電荷 pH = 8.08.3 , 負電荷，正極2.分子篩效應 小分子移動快 ，大分子移動慢3. 分子構象 閉環超螺旋線狀DNA開環DNA +-（二）操作要點 支持物 凝膠濃度的選擇 DNA分子量標準 電泳緩沖液 樣品制備 電泳條件 DNA電泳染色 DNA片段的回收 1. 支持物商品化的瓊脂糖瓊脂糖種類普通低熔點高純高篩分熔點8090100ng 上樣緩沖液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚藍/二甲苯青 點 樣6

33、.電泳條件 潛水電泳 恒壓電泳 低壓: 12V/cm 中壓: 810V/cm 高壓：幾十V/cm 溫度：1525 潛水電泳7.電泳染色 溴乙錠(ethidium bromide, EB) 結構及染色原理 染色方法加入凝膠液中 電泳結束后染色 EB染色原理紫外燈下顯色8. DNA片段的回收 低熔點瓊脂糖法 透析袋電洗脫法(5kb) DEAE-纖維素膜法(0.55kb)（三）應用范圍 DNA的分離、純化和鑒定 限制性酶切圖譜分析 重組體的分離、鑒定 雜交分析 PCR產物的分離鑒定 第二節 分子雜交 分子雜交的基本原理 固相支持物 探針 幾種常用雜交技術一、分子雜交的基本原理 核酸的變性和復性n核酸

34、分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復性過程中，如果把不同復性過程中，如果把不同DNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術的原理一、分子雜交與印跡技術的原理復性復性RNADNA雜交條件 靶分子-支持物 探針 雜交袋 雜交爐雜交種類 被檢核酸種類和方法 原位雜交斑點雜交

35、Southern雜交Northern雜交Western雜交 反應介質 液相雜交 固相雜交()二、固相支持物 硝酸纖維素濾膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龍膜(nylon membrane)1.硝酸纖維素濾膜 特點吸附ssDNA和RNA 本底低 不足不適于重復雜交濾膜較脆 不適于電轉移法 對DNA小片段(缺口翻譯 操作簡便 DNA/cDNA 探針 DNA的5末端標記(5end labeling) 堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶 標記原理 制備寡核苷酸探針 制備短的DNA/RNA探針 （一）印跡技術（一）印跡技術利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子利用各種物理

36、方法使電泳膠中的生物大分子轉移到轉移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。，譯為印跡技術。 用放射性核素、生物素或熒光染料標記其用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術（二）探針技術二、印跡技

37、術的類別及應用二、印跡技術的類別及應用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern Blotting)（三）蛋白質的印跡（三）蛋白質的印跡 (Western Blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。、重組質粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。 3 3、應用：、應用：（1 1）檢測某一組織或細胞中已知的特異）檢測某一組織或細胞中已知的特異 mRNAmRNA的表達水平的表達水平（2 2）比較不同組織和細胞

38、中的同一基因的）比較不同組織和細胞中的同一基因的 表達情況表達情況（三）蛋白質印跡（三）蛋白質印跡 (Western Blot) (Western Blot) 1 1、概念：、概念： 蛋白質在電泳之后可以被從膠中轉移和固定到蛋白質在電泳之后可以被從膠中轉移和固定到模型材料上，再與溶液中相應的蛋白分子相互結模型材料上，再與溶液中相應的蛋白分子相互結合，其中最常用的是用抗體檢測，因此被稱為免合，其中最常用的是用抗體檢測，因此被稱為免疫印跡。相對于疫印跡。相對于DNADNA的的Southern BlotSouthern Blot和和RNARNA的的Southern BlotSouthern Blot

39、，蛋白質印跡被稱為，蛋白質印跡被稱為Western BlotWestern Blot。2 2、基本過程：、基本過程： (1) (1) 電泳（電泳（ElectrophoresisElectrophoresis）：）： 一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用條件總要確一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相保蛋白質解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。互間的聚集。 最常用的方法是將強陰離子去污劑最常用的方法是將強陰離子去污劑SDSSDS與某一與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質解離后再加樣還原劑并用，并通過加熱使蛋白質解離后再加樣于電泳凝膠上。于電泳凝膠上

40、。 蛋白質從蛋白質從SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持體。體。 目前進行的目前進行的WesternWestern印跡反應大多還是從凝膠上印跡反應大多還是從凝膠上直接把蛋白質電轉移至硝酸纖維素濾膜之上。蛋直接把蛋白質電轉移至硝酸纖維素濾膜之上。蛋白質的轉移只有靠電轉移方可實現。白質的轉移只有靠電轉移方可實現。 (2) (2) 轉膜轉膜(Transfer)(Transfer)：(3)(3)封閉封閉(Blocking)(Blocking)： 封閉可能結合非相關蛋白的位點以降低這類非封閉可能結合非相關蛋白的位點以降低這類非特異性結合背景的效果。特異性結合背景的效果。

41、現已設計的封閉液有多種，其中脫脂奶粉最為現已設計的封閉液有多種，其中脫脂奶粉最為價廉物美，既使用方便又可與通常使用的所有免價廉物美，既使用方便又可與通常使用的所有免疫學檢測系統兼容。只有一種情況，也就是當牛疫學檢測系統兼容。只有一種情況，也就是當牛奶中可能含有要用奶中可能含有要用WestemWestem印跡法檢測的蛋白質印跡法檢測的蛋白質時，不能使用脫脂奶粉作為封閉劑。時，不能使用脫脂奶粉作為封閉劑。(4)(4)一抗孵育一抗孵育(Primary antibody incubation)(Primary antibody incubation)： 特異性抗體（一抗）和轉移膜上相應的蛋白分特異性抗

42、體（一抗）和轉移膜上相應的蛋白分子結合子結合. .(5)(5)二抗孵育二抗孵育(Secondary antibody incubation)(Secondary antibody incubation)： 堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶(HRP)(HRP)或放射性核或放射性核素標記的二抗與之反應。素標記的二抗與之反應。 二抗需根據一抗進行選二抗需根據一抗進行選擇。擇。 (6)(6)顯色：顯色：用放射自顯影或底物顯色檢測蛋白質區帶的用放射自顯影或底物顯色檢測蛋白質區帶的信號，底物亦可與化學發光劑結合以提高信號，底物亦可與化學發光劑結合以提高敏感度敏感度. .放放射射自自顯顯

43、影影照照片片n其他：其他：斑點印跡斑點印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA點陣點陣 (DNA array) DNA芯片技術芯片技術 (DNA chip)三種印跡技術的比較三種印跡技術的比較分子雜交實驗分子雜交實驗放放射射自自顯顯影影照照片片DNA點陣點陣n核酸序列分析的基本原理：核酸序列分析的基本原理： 化學裂解法化學裂解法 (Maxam-Gillbert法法) DNA鏈的末端合成終止法鏈的末端合成終止法 (Sanger法法)第三節第三節核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis一、

44、一、DNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法GATC 測序反應測序反應 電泳電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正極正極負極負極ddGddAddTddCn鏈末端合成終止法測定鏈末端合成終止法測定DNA序列的原理序列的原理二、二、DNA自動測序自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現采用熒光替代放射性核素標記是實現DNA序序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應測序反應，反應產物經電泳（平板電泳或毛

45、細管電泳）分離后，產物經電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發不同大小通過四種激光激發不同大小DNA片段上的熒光分片段上的熒光分子使之發射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒子使之發射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。堿基的排列順序。 ddGddAddTddC紅色紅色熒光熒光綠色綠色熒光熒光黃色黃色熒光熒光藍色藍色熒光熒光電泳電泳DNA序列自動分析原理及結果圖序列自動分析原理及結果圖四、Southern 雜交 Southern blotting/DNA blotting 1975年，Edwen Southern等 印跡(blot

46、ting) : 轉移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 1. 印跡的方法 毛細管轉移法 電轉移法 真空轉移法 毛細管轉移法 電轉移法2. Southern 雜交的步驟五、Northern 雜交 RNA blotting 步驟 總RNA/mRNA變性電泳分離轉移雜交放射自顯影/化學顯色 應用檢測組織/細胞中mRNA的大小、量 比較不同組織/細胞中基因的表達情況 Northern 雜交六、Western 雜交 免疫印跡(immunoblotting) SDS-PAGE轉移蛋白第一抗體標記的第二抗體(探針)檢測 應用-蛋白質的定性定量分析免疫印跡

47、Southern,Northern & Western待測物質 支持物 探針 轉移方式Southern DNANC 單鏈核酸 毛細管/電/真空 Northern RNANC/尼龍 單鏈核酸 毛細管/電/真空 Western 蛋白質NC/PVDF 抗體電轉移 第二節第二節聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應Polymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技術的技術的工作原理工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

48、5 5 5 2530 次循環后，模板次循環后，模板DNA的含量的含量可以擴大可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR體系基本組成成分體系基本組成成分n PCR的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第三節 PCR技術 聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction, PCR) PCR的基本原理和步驟 PCR的影響因素一、PCR的基本原理和步驟 基本原理DNA復制 三個步驟變性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(ex

49、tension) 標準的PCR反應體系 10X 擴增緩沖液： 10ul 模板DNA: 0.12ug 引物： 各0.21umol/L 4種dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 總體積： 100ul二、PCR的影響因素 模板 pg-ug 引物 0.1-0.5uM Taq DNA聚合酶 1-5U 4種dNTP 20-200uM Mg2+ 1.5-2.5mM 過高: 非特異擴增 過低 : 反應產物減少 循環條件 25-35 引物長度：1530nt G+C含量：4060% 堿基的隨機分布 避免引物自身和引物之間的互補 引物的3端 引物的5端

50、引物濃度：0.21umol/L 自動搜索：Primer Premier 5.0 在線設計：/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi 分析評價：Oligo 6.0循環條件 變性溫度和時間: 9096, 3060s 退火溫度和時間: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸溫度和時間7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min 循環次數: 2535 次 聚合酶鏈聚合酶鏈式式反應反應1. Denaturation2. Annealing3. ExtensionPCR.

51、EXE5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環后，模板次循環后，模板DNA的含量的含量可以擴大可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。Essential ComponentsEssential Components of of PCR ReactionPCR Reaction salts (ions)利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為模板獲為模板獲得已知目的基因片段得已知

52、目的基因片段, 或與逆轉錄反應相結合，直或與逆轉錄反應相結合，直接以組織和細胞的接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段；利用簡并引物從利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用隨機引物從利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆文庫或基因組文庫中克隆基因。基因。 二、二、PCR技術技術的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆利用利用PCR技術可以隨意設計引物在體技術可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。變等改造。 PC

53、R技術高度敏感，對模板技術高度敏感，對模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突變（二）基因突變將將PCR技術引入技術引入DNA序列測定，使測序序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測待測DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術的結合可以大大提高基與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性因突變檢測的敏感性 。（四）（四）DNA序列測定

54、序列測定（五）基因突變分析（五）基因突變分析 逆轉錄逆轉錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是是將將RNA的逆轉錄反應和的逆轉錄反應和PCR反應聯合應用的一種技術。反應聯合應用的一種技術。 RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。進行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆轉錄（一）逆轉錄PCR技術技術三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術衍生技術 原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細胞涂片上的單是在組織切片或細胞涂片上的單

55、個細胞內進行的個細胞內進行的PCR反應，然后用特異性探針進行原位反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測雜交，即可檢出待測DNA或或RNA是否在該組織或細胞中是否在該組織或細胞中存在。存在。 原位原位PCR方法彌補了方法彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的一種最佳方法。是將目的基因的擴增與定位相結合的一種最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技術技術熒光定量PCR技術 原理原理 熒光探針：熒光探針：(1) Molecular Beacon (2)TaqMan Molecular BeaconQ淬淬滅滅R 發光發光 特異性熒特異性

56、熒光雙標記光雙標記探針探針 Taq酶酶 5353外切酶活外切酶活性性(2) TaqManRQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標記探針（雙標記探針（Taqman Probe）定量定量: : 通過外標準來定量未知樣品通過外標準來定量未知樣品 標準品制備 1、 標準菌標準菌 2 、構建質粒、構建質粒 3 、化學合成基因片段、化學合成基因片段 標準品的定量標準品的定量 1、 標準菌：拷貝數已知標準菌：拷貝數已知（衛生部）（衛生部） 2 、無限梯度稀釋無限梯度稀釋： 高濃度按高濃度按10倍濃度梯度逐漸稀釋倍濃度梯度逐漸稀釋10n 10n-1 101 0 熒光定量P

57、CR設計流程靶基的選擇靶基的選擇設計引物與探針設計引物與探針制作標準曲線制作標準曲線 預實驗：特異性敏感性預實驗：特異性敏感性（三）實時（三）實時PCR技術技術實時實時PCR(real-time PCR)技術通過動態技術通過動態監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。 n實時實時PCR技術原理技術原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標記引物熒光標記引物RQ 3355基因克隆技術 c差示分析法大規模克隆技術gene map-based cloningRACE(rapid amp

58、lification of cDNA)技術 可以擴增缺失的DNA序列。 可以完成3和5的未知序列的擴增。5擴增3擴增文庫的構建與篩選 文庫 c文庫 篩選方法 基因組基因組DNA文庫文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫文庫(cDNA library) n基因文庫基因文庫( (gene library)是指一個包含了某一生物體全部是指一個包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫是指生物的文庫是指生物的基因組基因組DNA的的信息（包括所有的編碼區和非編碼區）以信息（包括所有的編碼區和非編碼

59、區）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。 用于構建基因組文庫的載體有用于構建基因組文庫的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。n基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫的構建和篩選文庫的構建和篩選第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選n基因組文庫篩選結果舉例基因組文庫篩選結果舉例cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部件下所表達的全部mRNAmRNA經逆轉錄而合成的經逆轉錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達

60、信息。式貯存著該組織細胞的基因表達信息。 二、二、cDNA文庫文庫第五節第五節生物芯片技術生物芯片技術Biological Chip Technique是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段有規律地緊密排片段有規律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統等光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統等對芯片進行掃描，通過計算機系統對每一位點的對芯片進行掃描，通過計算機系統對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結果。該技術亦被稱作