1、生物蛋白純化生物蛋白純化1引言親和層析的原理是：生物分子間存在很多特異性的相互作用，它們之間都能夠專一而可逆的結合，這種結合力就稱為親和力。親和層析就是通過將具有親和力的兩個分子中一個個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。被固定在基質上的分子稱為配體，配體和基質是共價結合的，構成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力的物質作為配體，并將配體共價結合在適當的不溶性基質上。將制備的親和層析劑裝柱平衡，當樣品溶液通過親和層析柱的時侯。待分離的生物分子就與配體發生特異性結合，從而留在固定相上；而其它雜質不能與配體結合

2、，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當的洗脫液將其從配體上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質。親和層析的優點是它分離蛋白經常只需要經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜生物蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。此外蛋白在純化過程中得到濃縮，結合到親和配基后，性質更加穩定，其結果提高了活性回收率。它可以減少純化步驟，縮短純化時間，對不穩定的蛋白純化十分有利。3 / 142材料2.1材料和試劑2.1.1菌株與質粒大腸桿菌BL21(DE3),Genscript保藏；表達載體pColdTF,Genscript保藏；pColdTF-Cementprotein,

3、Genscript構建。2.1.2主要試劑NiTDA親和層析凝膠：Genscript生產；LB液體培養基(g/L)：胰蛋白陳(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeastextract)5g/L,氯化鈉(NaCl)5g/L,用NaOH調節該培養基的pH為7.4；氨卡青霉素溶液：50Pg/mL；IPTG：0.5mmol/L：Tris-HCl：50mM,PH8.0；蛋白Marker:TIANGEN公司，MP102；LysisBuffer:50mMTris-HC1200mM：NaCl；PH8.0：WashBufferl:50mMTris-HC1200mM：NaCl；20mM咪嘎；PH8.0；

4、WashBuffer2:50mMTris-HC1200mM：NaCl；50mM咪啜；PH8.0；ElutionBuffer:50mMTris-HC1200mM：NaCl：250mM咪嗖；PH8.0：洗滌緩沖液：150mMpBS,0.5mLTween-20(0.13%),PH7.4；封閉液:脫脂奶粉(5%),PBS；蛋白電泳試劑：丙烯酰胺、甲義雙丙烯酰胺、蛋白質分子量標準為上海生工公司產品;丙烯酰胺儲備液：30%(w/v)丙烯酰胺，0.8%(w/v)甲叉雙丙烯酰胺；丙烯酰胺29.2g,中又雙丙烯酰胺0.8g,加蒸僚水至100mL,用濾紙過濾后于棕色瓶中4c存放；分離膠緩沖液（1.5M/L,pH8

5、.8）：18.15gTris（分析純），用1M/LHC1調節pH至8.8,加水至100mL,4存放；濃縮膠緩沖液（0.5M/L,pH6.8）：6gTris,用1M/LHC1調節pH至6.8,加水至100mL,4存放；Tris-甘氨酸電泳緩沖液:6gTris,28.8g甘氨酸,2gSDS,加水至2L；SDS溶液（10%）：lOgSDS,加水定容至100mL,完全溶解后室溫存放：過硫酸鍍溶液Q0%）：0.1g過硫酸鐵（分析純），加1mL蒸你水溶解；5X樣品緩沖液：0.6mLTris-HCl緩沖液（Imol/L,pH6.8）、51nL50%（v/v）甘油、2mLi0%SDS、0.5mLB一藻基乙醇、

6、ImLl%（w/v）'i臭酚藍、0.9mL蒸水。4存放；12與分離膠的配制：蒸儲水3.5mL,30%丙烯酰胺儲備液（A液）4mL,分離膠緩沖液（B液）2.5mL,10%生物蛋白純化過硫酸鍍50同，TEMED5同；5%濃縮膠的配制:蒸憎水2.3mL,30%丙烯酰胺儲備液（A液）0.67mL,濃縮膠緩沖液（C液）1.0mL,10%過硫酸筱30色,TEMED5M；考馬斯克藍染色液：考馬斯克藍R-2501g,甲醇450mL,冰醋酸100mL,蒸儲水450mL：脫色液：甲醇200mL,冰醋酸200mL,蒸儲水1600mL。封閉液：5%脫脂牛奶或者20%BSA2. 1.3主要儀器PK-8D型電熱恒

7、溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）TH2-25大容量恒溫震蕩器（上海欣蕊自動化設備有限公司）JY98-3D超聲細胞破碎儀（宇波新芝生物科技有限公司）GL21K高速離心機（湖南湘儀儀器有限公司）HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器廠）IHZD-3紫外檢測儀（上海滬西分析儀器廠）TH-300梯度混合器（上海滬西分析儀器廠）5414D型臺式高速離心機（美國Eppendrof公司產品）垂直板狀電泳系統（Bio-Rad公司產品）移液槍（DAIGGER）水浴鍋DK-8D（上海一恒儀器）3 / 14生物蛋白純化3方法與步驟3. 1Cementprotein重組質粒的轉化不1）取重組質粒；pColdTF-Ceme

8、ntprotein仲1于100R1感受態細胞BL21中，冰浴30min；2）42水浴熱激90s；3）立即放置冰上冰浴3min：4）加入600M37預熱的LB液體培養基，搖床震蕩培養30min：5）12000rpm離心2min,棄400M培養基，剩約200間，混勻菌體,涂布平板（A）37c過夜培養；3.2Cementprotein優化與表達鑒定41）取5支4mlLB試管培養基分別標記對照、1、2、3。2）其中對照中加入50ul葡萄糖，對照、1、2、3,分別加入4ulA,從平板中挑取5個白色菌落。分別加入5支試管。3）對照、1、2、37c搖床培養，待0D=0.6時，加4ulIPTG,37,誘導培養

9、4h；4） 4號試管37c搖床培養，待0D=0.6時,加2uHPTG,15,過夜誘導12h；5）取4只EP管分別標記對照、1、2、3。6）從試管中取200ul菌體，依次加入EP管中。7） llOOOrpm,4min,4c離心4min,去上清。8）沉淀用15NlTris重懸；再加入15同2XLoadingBuffer,沸水煮15nlin,離心，SDS-PAGED51電泳檢測。3.3Cementprotein可溶性分析1）取4支1.5mlEP管標記1-沉淀、1-上清、3-沉淀、3-上清、取表達鑒定的1號管和3號管菌液分別加入1-沉淀、3-沉淀，5000rpm,3min,離心去上清，沉淀用200ul

10、Tris重懸。2）超聲破碎冰水浴引（間歇時間：3s;工作時間：3s；全程時間：10min；）o3） 5000rpm,3min,離心，上清液分別倒入上清、3-上清中，1-沉淀、3-沉淀中沉淀用200ulTris重懸，4支EP管各加入200ul2XLoadingBuffer混勻沸水浴15分鐘。4） 4支EP管各取8ul進行SDS-PAGE檢測。3.4Cementprotein擴大培養1）接種，1%的接種量，接種到41nL液體LB培養基中，30,200rpm，搖床培養過夜，即種子液；2）轉接，4mL的種子液轉接到1LLB搖瓶，并向其中加入800M的A*,37,180rpm搖床震蕩培養4h：3）誘導，

11、1L培養基加入400同的IPTG,于15搖床內，180rpm,過夜誘導12h；4）收菌，7000rpm,7min,4離心收集菌體，收集的菌體放于-20備用。3. 5蛋白RAC-22的純化3.5. 1.超聲破碎：1）1L培養液菌體用30血±丫515811££01'重懸，將菌液置于冰水中，超聲破碎（間歇時間：3s;工作時間:3s；全程時間：15min；）；3.5.2. 菌體分離：卬1）破碎液11000RPM離心15分鐘。取上清。C.Ni柱純化蛋白1）裝柱：將層析柱洗凈，用去離子水潤洗柱子及管道，用適量的Ni-IDA介質（5ml）裝入層析柱中；2）平衡：靜置完成

12、后，用LysisBuffer平衡介質至紫外檢測儀示數穩定；3）上樣：上清液以Iml/min的速度上樣；4）洗雜：上樣完成后，先用LysisBuffer洗滌；而后用WashBufferl洗滌雜蛋白至紫外檢測儀數值趨于穩定。并收集樣品。標記“20”。再用WashBuffer2洗滌至紫外檢測儀數值趨于穩定。并收集樣品，標記“50”。5）洗脫：用£山近。疝成£6洗脫目標蛋白，當紫外檢測儀的示數開始變化后，取20ul加入350ul的G250中觀察顏色變化。當有G250由棕色變為藍色時，開始收集流出液于無菌的塑料瓶中,洗脫直至樣品不再使G250變藍并紫外檢測儀示數不再下降。3. 5.3

13、透析卬:1）取2000ml透析液，將洗脫所得的溶液裝入透析袋中，4,過夜透析12h,4. 5.4.蛋白復性：將蛋白稀釋至100ul/ml的速度加入20倍體積的0.1M磷酸鹽緩沖液.菌液于7000RPM,離心20分鐘.取上清。5. 5.5.蛋白濃度和純度的檢測1）蛋白濃度測定,取3mlG250,加入比色皿中。A調100%,T調零。取透析所得的蛋白溶液，50ul加入3MLG250中混勻，待分光光度計數值不再變化，記錄數值。6. 電泳檢測蛋白純度，將蛋白電泳圖片經專業軟件測定蛋白純度。取樣，取10N1電泳。3.6.蛋白印記檢測（Westernblot）1013. 6.1電泳1）取樣,取1011,SD

14、S-PAGE電泳。4. 6.2轉膜1）準備4-6張濾紙和1張PVDF膜或C膜。戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。轉膜前，NC膜要置于去離子水中浸泡Imin；PVDF膜應在中隧溶液中浸泡20min。2）在轉移液里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒或滴管、濾紙和浸過的膜。3）取出SDS-PAGE膠將濃縮膠輕輕刮去。將膠在轉膜緩沖液中浸泡5分鐘左右，以平衡離子強度。4）打開平放底部黑色電極（陰極），放一張海綿墊片，搟氣泡。于海綿墊片上放置2-3張用轉移緩沖液浸泡過的濾紙，逐張疊放，對齊，搟氣泡。取出浸在轉膜液中的凝膠平放于濾紙上，排除所有氣泡。將PVDF膜或NC膜置于聚丙烯酰胺凝膠上，排除

15、所有氣泡。在膜上蓋上2-3張轉移緩沖液浸泡過的濾紙，排除所有氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，放上另一張或兒張海綿墊片，蓋上陽極板（白色），夾緊。保證對凝膠有一定的壓力。5）將夾子放入轉移槽中。轉膜在冰上進行，用磁力攪拌器攪拌。用恒壓60V或恒流200mA轉移2h-2h30min。3. 6.3轉膜免疫反應1）取膜，將膜正面超上在PBST溶液中搖動五分鐘，移至含有封閉液的平皿中，室溫脫色搖床上4度靜置過夜。2）取出膜在PBST溶液中洗5分鐘，放入含有一抗的PBST緩沖液中，室溫下孵育L5h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min：3）膜放入含有二抗的PBST溶液中，室溫下孵育L5h后，用P

16、BST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min：再用PBS洗二次，每次5min,進行化學發光反應。4. 6.4化學發光，顯影，定影1）將A和B兩種試劑（Genscript公司HRP標記的底物）在離心管中上等體積混合，避光保存；用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的液體，正面朝上置與平整的保鮮膜上，加上以上的A、B混合液2ml,使膜正面與液體充分接觸，避光靜置3分鐘；3min后，用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的液體，置與另一平整的保鮮膜上，包好，放入X-光片夾中。2）在暗室中，將IX顯影液和定影液各500nli分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X光片;用切紙刀剪裁適當大小；把X光片放在膜上，關上

17、X-光片夾，曝光3分鐘，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。立刻將X-光片浸入定影液中，定影lOmin,用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。12 / 144.結果與分析4. 1.Cementprotein的表達鑒定11挑取菌落至4mL培養基培養，標記對照、1、2、3,搖床培養當ODw產0.6時加入4U1IPTG,而后對照、1、2、37c誘導4小時，3號試管15c過夜誘導12h,離心收集菌體，取樣進行SDS-PAGE電泳分析。Cementprotein表達鑒定檢測圖1.1如圖所示，根據專業用 無目的蛋白的表達，1 誘導58kd處也有明顯望對照1

18、23 MlOOkd 75kd5Okd32kd25kd15kd3kdo對照組沒有58kd處 條帶。3號為15、過夜圖1.lCementprotein64P-BAl蛋白表達鑒定Lanel：對照lane2：1.號Lane3：2號lane4：3號Lane5：M4. 2.Cementprotein的可溶性分析取上述1號管3號管菌液400ul分別加入2支EP管中，離心去上清，沉淀用200ulTris重懸。冰水浴超聲破碎。離心，上清液取樣電泳，沉淀用200ulTris重懸，電泳。Cementprotein可溶性分析檢測圖3.2如圖所示,1-上清1-沉淀3-上清3-沉淀MlOOkd 75kd5Okd32kd2

19、5kd15kd因為蛋白在上清中活性較高，這意味著雷片不施圻怒索高.易行和坤休結合.苑伊昕俎雷白在枇櫛高.而15、過夜誘導蛋白圖1.2Cementprotein64P-BAl蛋白可溶性分析導。這就是所謂的優先Lanel：對照lane2：1號Lane3：2號lane4：3號Lane5：M4. 3.Cementprotein的分離純化本實驗采用NiTDA親和層析一步純化蛋白金團ehtprotein,最終得到的融合蛋白純度能達到90%以上，Cementprotein的分離純化檢測圖lOOkd 75kd50kd32kd25kd15kd圖1.3Cementprotein64P-BAl蛋白純化檢測圖Lane

20、l：全菌lane2：上清Lane3：流出lane4：20Lane5：50Lane5：250如圖所示Lanel為全菌破碎后蛋白條帶58KD處有明顯表達條帶；Lane2為上清中蛋白條帶58KD處有明顯表達條帶；lane3為上清過柱后流出條帶；融合蛋白表達條帶降低很多，說明融合蛋白大量掛柱；Lane4為20mm咪唾洗滌后流出有雜質和部分融合蛋白洗出；Lane5為50mm咪唾洗滌后流出有雜質和部分融合蛋白洗出；Lane6為250mm咪啜洗脫后流出融合蛋白被大量洗脫，且濃度和純度很高。5. 4.Cementprotein的WesternbIot檢測Cementprotein的WesternbIot檢測圖

21、圖L4Cementprotein的Westernblot檢測圖如圖WesternbIot檢測58批婚拈a鈉i包南帶融流蹶物化得到蛋白為實驗預期純化的融合蛋白。5結論5.1. 本實驗利用Ni離子與咪陛基特異的親和性,使螯和有Xi離子的親和層析柱可以用來純化含有組氨酸的融合蛋白，在Cementprotein經過重組后，融合蛋白帶上了HIS標簽,在純化時可以特異性結合在層析柱上，用含高味陛的ElutionBuffer溶液使蛋白Cementprotein與雜蛋白分開由電泳的檢測結果可知，用這種簡單、快捷的一步純化的方法,能夠得到達到電泳純的蛋白，而HIS標簽并不影響蛋白Cementprotein的活性

22、；5.2. 重組后的蛋白Cementprotein雖然很穩定，但在純化的過程當中還要使蛋白溶液始終保持在低溫冰浴的環境中。接觸到蛋白的容器一定要滅菌干凈，避免雜菌的污染；6. 3.在用IPTG進行誘導表達時先做一個濃度梯度，實驗發現終濃度在ImM,溫度為37,時間為4h,融合蛋白產生量最多，但易形成包涵體。終濃度為0.5mM,溫度為15C,時間為12h,上清中融合蛋白增多。參考文獻14趙永芳編著。生物化學技術原理及其應用（第二版）。武漢大學出版社.E2SvenLofdal,BengtGuss,MathiasUhlen,LennartPhi1ipson,andMartinLindberg.geneforStreptococcalProteinG.Proc,Natl,Acad,Sci,USA,Vol.80,pp697-701,Februaryl9833范代娣，沈立新，米玨編著。重組蛋白分離與分析o化學工業出版社，4（德）R.M.Kamp,（德）B,Wittmann-Liebold,（希臘）T.Choli-Papadopoulou。蛋白質結構分析:制備，鑒定與微量測序,北京科學出版社5phyllis»nanodb,蛋白質電泳實驗技術6葉