1、外源基因在大腸桿菌中的表達形式位于位于細胞質細胞質細胞周質細胞周質細胞外細胞外表達產物表達產物形式形式包涵體蛋白包涵體蛋白融合蛋白融合蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白細胞質中表達: 外源基因在大腸桿菌寄主細胞質中高效表達時，常會發生一種特殊的生理現象，形成包涵體。 包涵體：存在于細胞質中的一種由不可溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物。包涵體表達形式的優點 在一定程度上保持表達產物的結構穩定 能夠避免細胞內蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集 簡化外源基因表達產物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌 體經超聲波裂解后，直接通過高速離心

2、即可將重組異源蛋白從細 菌裂解物中分離出來 能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白。包涵體表達形式的缺點 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復性操作，才能得到有正確空間構象的目標蛋白。 體外復性蛋白質的成功率相當低，一般不超過 30% 復性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。包涵體加工流程包涵體加工流程去除細胞碎片去除細胞碎片（ 膜蛋白和脂類等）膜蛋白和脂類等） 包涵包涵體體提提取取n如何對包涵體蛋白進行高效體外復性以獲得活性產品是生物工程產業化經常面臨的一個難題包涵體的洗滌包涵體的洗滌 為除去包涵體上粘附的雜質，應用為除去包涵體上粘附的雜質，應用洗

3、滌液洗滌液洗滌洗滌包涵體沉淀包涵體沉淀 常用常用去污劑去污劑Triton X-l00或或脫氧膽酸鈉脫氧膽酸鈉和和低濃度變性劑低濃度變性劑（如（如2mol/L尿素或鹽酸胍等，洗滌尿素或鹽酸胍等，洗滌以除去脂類和膜蛋白以除去脂類和膜蛋白。 如：如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，尿素，1mM EDTA包涵體的溶解包涵體的溶解大多數在大多數在pH8的條件下，用的條件下，用強變性劑強變性劑如如8mol/L尿素、尿素、 6mol/L鹽酸胍，鹽酸胍，打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展n對于含有S-S的蛋

4、白質，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵n為將包涵體充分溶解，需加入還原劑（如二硫蘇糖醇 DTT、GSH、巰基乙醇 -ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，一般是50-100mM -ME或DTT（對于目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應使用還原劑，因為含S-S的雜蛋白會影響包涵體的溶解）n同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子，防止已經處于還原狀態的SH-與之發生氧化反應。 包涵體溶解后，蛋白質成為失去了生物學活性伸展肽鏈蛋白質復性機理蛋白質復性機理蛋白質復性過程中，涉及兩種疏水相互作用：蛋白質復性過程中，涉及兩種疏水相互作用：一是一是分子內的疏水

5、相互作用分子內的疏水相互作用促使蛋白質正確折疊促使蛋白質正確折疊二是二是肽鏈分子間的疏水相互作用肽鏈分子間的疏水相互作用導致蛋白質分子間聚集，形導致蛋白質分子間聚集，形成寡聚體和多聚體成寡聚體和多聚體再進一步聚集形成沉淀再進一步聚集形成沉淀n兩者互相競爭，影響蛋白質復性收率。n復性過程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復性收率的關鍵。局部肽段先由氫鍵形成一些二級結構構象單元，如螺旋、折疊、轉角等一般說來，在優化的條件下，大多數蛋白質體外復性效率一般說來，在優化的條件下，大多數蛋白質體外復性效率在在20%左右左右 復性常用方法復性常用方法1. 稀釋復性稀釋復性： 直接加入水或復性緩沖

6、液，缺點是體積增加直接加入水或復性緩沖液，缺點是體積增加較大，后續處理困難。較大，后續處理困難。 2.透析復性透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸降：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，不低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，不適合大規模操作。適合大規模操作。 3. 超濾復性超濾復性：選擇合適載留分子量的膜，允許：選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質通不過。缺點是不適合樣品變性劑通過膜而蛋白質通不過。缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性（逆的變性（蛋白聚集于膜上蛋白聚集

7、于膜上）。）。4. 色譜復性色譜復性：兼具分離。：兼具分離。4.1 凝膠過濾復性凝膠過濾復性：該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，對有些膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，對有些蛋白質的復性有利。蛋白質的復性有利。4.2吸附型層析復性吸附型層析復性：原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝膠介質上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑膠介質上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復性緩沖液將吸附的蛋白洗脫下和雜蛋白，最后用復性緩沖液將吸附的蛋白洗脫下來，在來，在洗脫過程中完成復性。洗脫過程中完成復性。各類氨基酸自動測序儀各類氨基酸自動測序儀原核細菌表達的重組蛋白產物的質量檢測項目與方法檢測項目檢測方法產品是否含內毒素家兔熱原法蛋白質是否變異肽譜、HPLC、等電聚焦、毛細管電泳甲硫氨酸是否被甲酰化肽譜、質譜、HPLC、Edman分析蛋白質是否變性、聚合、脫氨基SDS-PAG