1、免疫比濁分析技術原理與進展桂林英美特生物技術研究所一、免疫學基本原理二、免疫沉淀三、免疫比濁技術原理免疫比濁檢驗技術原理與進展一、免疫學基本原理1、抗原與抗體2、抗原抗體的結合免疫學反應3、免疫學反應的檢測技術1、抗原與抗體l抗原抗原（Antigen, Ag）是）是刺激機體產生免疫刺激機體產生免疫應應答答的物質。的物質。 l“應應” 是指抗原刺激機體產生是指抗原刺激機體產生免疫應答產物免疫應答產物- - -抗體或免疫效應細胞抗體或免疫效應細胞l“答答” ” 是指相應抗原與免疫應答產物結合并是指相應抗原與免疫應答產物結合并將其排除體外）將其排除體外）l抗原的免疫原性和免疫反應性抗原的免疫原性和免

2、疫反應性l完全抗原與半抗原完全抗原與半抗原l抗原表位與抗原結合價位抗原表位與抗原結合價位1、抗原與抗體1、抗原與抗體l免疫原性免疫原性 免疫原性（免疫原性（immunogenecity）是指是指抗原分子能夠刺激機體產生免疫應答（產生特抗原分子能夠刺激機體產生免疫應答（產生特異性抗體及免疫效應細胞）的性質。異性抗體及免疫效應細胞）的性質。免疫原性示意圖免疫原性示意圖1、抗原與抗體l免疫反應性：是指抗原分子與免疫應答產物免疫反應性：是指抗原分子與免疫應答產物（抗體或免疫效應細胞）發生特異性結合的性（抗體或免疫效應細胞）發生特異性結合的性質。質。致敏致敏抗體1、抗原與抗體完全抗原完全抗原（compl

3、ete antigen) 具有免疫原性和抗原具有免疫原性和抗原性的物質。性的物質。半抗原半抗原（hapten，又稱不完全抗原，又稱不完全抗原 incomplete antigen ）無免疫原性，只有抗原性的物質。無免疫原性，只有抗原性的物質。 載體（載體（carrier）賦予半抗原以免疫原性的蛋白質。賦予半抗原以免疫原性的蛋白質。 半抗原半抗原 + 蛋白質（載體）蛋白質（載體） 完全抗原。完全抗原。 BThBBBTh半抗原半抗原載體效應示意圖載體效應示意圖半抗原半抗原 + + 蛋白質（載體）蛋白質（載體） 完全抗原完全抗原1、抗原與抗體抗原決定簇抗原決定簇：抗原分子存在的能：抗原分子存在的能T

4、CR/BCR或抗體或抗體Fab片片段特異性結合的特殊化學基團，是免疫應答特異性的段特異性結合的特殊化學基團，是免疫應答特異性的物質基礎。物質基礎。構象決定簇構象決定簇 ：構象決定簇（：構象決定簇（conformational determinant）由空間構象形成的決定簇，序列上不連續。由空間構象形成的決定簇，序列上不連續。順序決定簇：順序決定簇（順序決定簇：順序決定簇（sequence determinant），又），又稱線性決定簇（稱線性決定簇（linear determinant），序列相連續的），序列相連續的氨基酸肽片段構成的決定簇。氨基酸肽片段構成的決定簇。抗原結合價抗原結合價：抗原

5、結合價（：抗原結合價（antigenic valence）是指能夠）是指能夠與抗體分子結合的決定簇數目。與抗體分子結合的決定簇數目。1、抗原與抗體1、抗原與抗體l抗原表位的性質、數目、位置、空間排列和立體構象決抗原表位的性質、數目、位置、空間排列和立體構象決定著抗原定著抗原- -抗體反應的高度特異性抗體反應的高度特異性。1、抗原與抗體共同表位共同表位（common epitope）指）指不同抗原之間含有的相同或相似的抗不同抗原之間含有的相同或相似的抗原表位。原表位。交叉反應交叉反應（cross-reaction）指）指抗體或致敏淋巴細胞對具有相同或相似抗體或致敏淋巴細胞對具有相同或相似表位的不

6、同抗原均具有的反應（交叉結合）。表位的不同抗原均具有的反應（交叉結合）。1、抗原與抗體抗體抗體（antibody, Ab）功能性概念）功能性概念 是由抗原刺激而產生并能與刺激其產生的抗原發生是由抗原刺激而產生并能與刺激其產生的抗原發生特異性結合的、特異性結合的、具有免疫功能的球蛋白具有免疫功能的球蛋白。抗體主要存在。抗體主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。以及乳汁等其它體液中。 免疫球蛋白免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）結構性概念）結構性概念 具有具有抗體活性抗體活性或化學結構或化學結構

7、與抗體分子相似與抗體分子相似的的球蛋白球蛋白。 抗體一定是球蛋白，球蛋白未必是抗體 1、抗原與抗體1、抗原與抗體“Y”型，四肽鏈型，四肽鏈重鏈重鏈 （5種種: 、 、 、 、 ） 輕鏈輕鏈 （2種種: 、）可變區可變區 （V區）區） 超變區超變區（ 又稱又稱CDR 互補互補決定區）決定區） 骨架區骨架區: FR恒定區恒定區 （C區）區）鉸鏈區鉸鏈區1、抗原與抗體根據重鏈抗原性的不同，免疫球蛋白可以根據重鏈抗原性的不同，免疫球蛋白可以分為分為5 5類：類： IgG (gamma) IgA (alpha) IgM (mu) IgD (delta) IgE (epsilon) 1、抗原與抗體根據輕鏈

8、根據輕鏈C區抗原性不同，免疫球蛋白可分區抗原性不同，免疫球蛋白可分為為2 2型型) ) (kappa) )型型 (lambda) )型型輕鏈存在于各類免疫球蛋白中輕鏈存在于各類免疫球蛋白中同一個免疫球蛋白分子中的輕鏈同型同一個免疫球蛋白分子中的輕鏈同型1、抗原與抗體抗體的生物學功能抗體的生物學功能特異性結合抗原特異性結合抗原 超變區表位超變區表位 靜電力、氫鍵、范德華力靜電力、氫鍵、范德華力 可逆可逆 影響因素：影響因素：PHPH、溫度溫度、電解質電解質 2、抗原抗體的結合免疫學反應l抗原抗體反應的原理 l抗原與抗體能夠特異性結合是基于兩種分子間的結構互補性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分

9、子的一級結構決定的。 l抗原抗體反應可分為兩個階段。第一為抗原與抗體發生特異性結合的階段，此階段反應快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現可見反應。第二為可見反應階段，抗原抗體復合物在環境因素（如電解質、pH、溫度、補體）的影響下，進一步交聯和聚集，表現為凝集、沉淀、溶解、補體結合介導的生物現象等肉眼可見的反應。l抗原抗體的結合使電荷減少或消失，蛋白質由親水膠體轉化為疏水膠體。 l四種分子間引力（電荷引力、范登華引力 、氫鍵結合力 和疏水作用 ）參與并促進抗原抗體間的特異性結合。 2、抗原抗體的結合免疫學反應典型的抗原抗體結合反應特異性識別形成抗原抗體復合物2、抗原抗體的結合免疫學反應l抗原抗體反應的

10、特點 特異性特異性按比例按比例可逆性可逆性2、抗原抗體的結合免疫學反應 Antigen added 2、抗原抗體的結合免疫學反應l影響抗原抗體反應的因素l電解質（離子強度）：抗原與抗體發生特異性結合后，雖由親水膠體變為疏水膠體，若溶液中無電解質參加，仍不出現可見反應。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和C1，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢下降。當電勢降至臨界電勢（1215mV）以下時，則能促使抗原抗體復合物從溶液中析出，形成可見的沉淀物或凝集物。l酸堿度（pH）：抗原抗體反應必須在合適的pH環境中進

11、行。蛋白質具有兩性電離性質，因此每種蛋白質都有固定的等電點。抗原抗體反應一般在pH為68進行。PH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質，例如pH達到或接近抗原的等電點時，即使無相應抗體存在，也會引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽性反應。l溫度：在一定范圍內，溫度升高可加速分子運動，抗原與抗體碰撞機會增多，使反應加速。但若溫度高于56時，可導致已結合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；在40時，結合速度慢，但結合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應溫度為37。每種試驗都有其獨特的最適反應溫度，例如冷凝集素在4左右與紅細胞結合最好，20以上反而解離。l其它：適當振蕩也可促進抗原抗體分子的接觸，

12、加速反應。3、免疫學檢測技術凝集與沉淀比濁電位、微天平放射性核素標記酶標記、熒光標記和膠體金標記化學發光物標記或偶聯化學發光反應 非標記免疫檢測技術標記免疫檢測技術二、免疫沉淀凝集：細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原，在適當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現凝集，稱為凝集反應（agglutination）是最經典的免疫學檢測技術。 二、免疫沉淀l免疫沉淀反應免疫沉淀反應:(precipitation) 可溶性抗原與相應抗體，在適宜條件下發生結合，出現的沉淀現象。免疫沉淀液體內沉淀反應凝膠內沉淀反應免疫電泳技術免疫濁度技術絮狀沉淀試驗環狀沉淀試驗單向擴散試驗雙向擴散試驗試管法平板法免疫電泳對流免疫

13、電泳火箭免疫電泳免疫固定電泳透射免疫比濁turbidimetermeasure 散射免疫比濁nephelomitermeasure 1:21:41:81:16 1:32 1:64 1:128各管抗原倍比稀釋各管抗原倍比稀釋加入抗血清加入抗血清各管抗體量不變各管抗體量不變振搖振搖 混勻、混勻、37孵育孵育沉淀量不同沉淀量不同試管內絮狀沉淀試驗試管內絮狀沉淀試驗輕搖輕搖絮絮 狀狀 沉沉示示 意意 圖圖淀淀AgAbAgAbAg凝膠內沉淀凝膠內沉淀試管法試管法單單向向瓊瓊脂脂擴擴散散試試驗驗凝膠內沉淀試驗凝膠內沉淀試驗平板法平板法標準品抗原濃度測定標準品抗原濃度測定不同病人抗原濃度測定不同病人抗原濃度

14、測定 將一定量的抗體混入將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測抗瓊脂凝膠中，使待測抗原在凝膠中自由擴散，原在凝膠中自由擴散，與相應抗體結合形成沉與相應抗體結合形成沉淀環，沉淀環大小與抗淀環，沉淀環大小與抗原濃度呈正相關。原濃度呈正相關。 凝膠內沉淀雙向瓊脂擴散原理示意圖AbAg模擬圖模擬圖染色瓊脂圖染色瓊脂圖1.1.抗原抗體雙向自由擴散抗原抗體雙向自由擴散2.242.24小時出結果小時出結果3.3.呈現沉淀線或弧呈現沉淀線或弧三、免疫比濁技術原理 當當可溶性抗原可溶性抗原與相應抗體特異結合，二者與相應抗體特異結合，二者比例合適比例合適時，在時，在特殊特殊的緩沖液的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗

15、原抗體復合物，使反應液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復合物，使反應液體出現濁度。利用現代光學測量儀器對濁度進行測定從而檢測抗體出現濁度。利用現代光學測量儀器對濁度進行測定從而檢測抗原含量原含量。 檢測器檢測器光源光源 透鏡透鏡 濾光片濾光片平光線平光線散散射射透射光透射光光波光波比濁測定法原理示意圖比濁測定法原理示意圖d當復合物大于入射光波的1/20時，形成不對稱前向散射，在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表復合物的量 當復合物小于入射波長時呈全透射，透射與散射相當 三、免疫比濁技術原理免疫比濁技術分類：按光路透射免疫比濁散射免疫比濁按測定時間終點比濁速率比濁按增敏劑無

16、增敏PEG增敏膠乳增敏透射比濁法和透射比濁法和散射比濁法光路散射比濁法光路檢測器檢測器A檢測器檢測器B IC I0 I I 透射比濁法透射比濁法 散射比濁法散射比濁法單色器透透射射比比濁濁計計散射散射比濁計比濁計散射比濁和透射比濁的區別示意圖散射比濁和透射比濁的區別示意圖透射光散射光散射光 透射免疫比濁法透射免疫比濁法（transmission turbidimetry抗原與抗體在一定緩沖液中形成抗原與抗體在一定緩沖液中形成ICIC，當光線透過反應溶液時，由，當光線透過反應溶液時，由于溶液內于溶液內ICIC粒子對光線的反射和粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，吸收，引起透射光減少，ICIC

17、越多越多透射光越少，可用吸光度表示。透射光越少，可用吸光度表示。透射免疫比濁法透射免疫比濁法反應要求反應要求透射免疫比濁法l靈敏度較低。要求抗原抗體復合物分子應足夠大、足夠多，分子太小則入射光直接通過。加增敏劑。l直線光路，靈敏度有先天缺陷。設計散射比濁。l透射比濁是依據透射光減弱的原理來定量的，因此只能測定抗原抗體反應的第二階段，檢測仍需抗原抗體溫育反應時間，檢測時間較長。缺陷缺陷散射免疫比濁法散射免疫比濁法 抗原抗體復合物對一定波長的光產生折射、偏轉，偏轉角度及散射光強度與復合物粒子的大小和量有關原理原理單色器散射散射比濁計比濁計散射光散射光散射免疫比濁法散射免疫比濁法l定時散射比濁分析基

18、本原理： 免疫沉淀反應和散射比濁分析結合之技術，反應分兩個階段，預反應階段和反應階段保證抗原不過量的方法： 確保反應體系抗體過量 對抗原過量進行閾值限定時間時間檢測分兩個檢測分兩個在預反應時段，在預反應時段，加小量樣本與加小量樣本與抗原抗原/ /抗體反應，抗體反應，測定第一次散測定第一次散射光信號值射光信號值加全量樣本，加全量樣本，約反應約反應 2 2分分鐘后，第二鐘后，第二次測定散射次測定散射光信號光信號信號峰值信號峰值計算機處理計算機處理轉換為樣轉換為樣品濃度品濃度預反應階段5ul樣本抗原過剩區閾值信號反 應 階 段45ul樣本7.5秒2分鐘定時散射比濁反應曲線圖定時散射比濁反應曲線圖抗原

19、不過量抗原過量散射免疫比濁法散射免疫比濁法l速率散射比濁分析基本原理： 抗原抗體結合反應的一種動態測定法，適時檢測抗原抗體復合物形成的散射光信號。是測定抗原抗體結合反應的動態過程。 所謂速率，是在單位時間內抗原抗體結合形成復合物的速度。將各單位時間內形成復合物的速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態的速率比濁分析。 當儀器測定到某一時間內形成速率下降時，即出現速率峰，該峰值的高低，即代表所測抗原的量。 速率峰值一般在25秒時出現。 在反應介質中加入一定量的促凝劑，可加速抗原抗體復合物的形成，以減少反應時間。 速率法的優點：是快速、不需要減去樣本和試劑本底讀數，校正結果也較穩定。抗原濃度遞增抗

20、原濃度遞增散射光峰值散射光峰值峰值信號與抗原抗體反應之間的關系圖峰值信號與抗原抗體反應之間的關系圖ABCDFGHI反應時間（秒）06085散射率抗體過量抗原過量第二峰值信號粒子增強免疫比濁分析技術l基本原理 選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒吸附或交聯抗體后，當遇到相應抗原時，則發生聚集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內，光線可透過。當兩個膠乳顆粒凝聚時，則使透射光減少，這種減少的程度與膠乳凝集成正比，當然也與抗原量成正比。 特點：變非均相反應為均相反應，靈敏度提高（ 0.1ng/mL ）； 聚乙烯、聚苯乙烯等高分子膠乳顆粒，直徑100200nM; 以物理吸附（多抗）或化學交聯（單抗）方式與抗體

21、連接； 基于單抗膠乳免疫散射速率比濁技術的定量分析是發展方向。光波光波dd 2d當粒子直徑小于入射波長時呈全透射，透射與散射相當 當粒子直徑大于入射光波的1/20時，形成不對稱前向散射，在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表復合物的量 特定蛋白分析儀簡介l以免疫比濁法原理設計的特定蛋白分析儀有1970年 Immuno Preciptin）、1977年BEHRING公司開發的BL（(Behring Laser Nephelometer)）、而后該公司又先后于1985年研制出BN（Behring Nephelometer Analysers）、1987年研制出TTS（Turbi Time System）和1988年