1、第二章第二章 噬菌體的相關技術噬菌體的相關技術一、噬菌體的侵染過程：一、噬菌體的侵染過程： 1.吸附吸附 2.侵入侵入 3.增殖增殖 4.成熟（裝配）成熟（裝配） 5. 釋放釋放 1.吸附吸附：當噬菌體與其相應的特異宿主在水：當噬菌體與其相應的特異宿主在水環境中發生偶然碰撞后，如果尾絲尖端與環境中發生偶然碰撞后，如果尾絲尖端與宿主細胞表面的特異性受體（蛋白質、多宿主細胞表面的特異性受體（蛋白質、多糖或者脂蛋白糖或者脂蛋白-多糖復合物等）接觸后，就多糖復合物等）接觸后，就可觸發頸須把卷緊的尾絲散開，隨即就附可觸發頸須把卷緊的尾絲散開，隨即就附著在受體上，從而把刺突、基板固著于細著在受體上，從而把

2、刺突、基板固著于細胞表面。胞表面。 吸附作用受許多外來因素的影響，如吸附作用受許多外來因素的影響，如噬菌體的數量，陽離子濃度，溫度和輔助噬菌體的數量，陽離子濃度，溫度和輔助因子（色氨酸、生物素等）因子（色氨酸、生物素等）2.侵入侵入：吸附后尾絲收縮，基板從尾絲：吸附后尾絲收縮，基板從尾絲中獲得一個構象刺激，促使尾鞘中的中獲得一個構象刺激，促使尾鞘中的144個蛋白質亞基發生復雜的移位，并緊縮個蛋白質亞基發生復雜的移位，并緊縮成原長的一半，由此把尾管推出并插入成原長的一半，由此把尾管推出并插入細胞壁和膜中。此時尾管端所攜帶的少細胞壁和膜中。此時尾管端所攜帶的少量溶菌酶可把細胞壁上的肽聚糖水解，量溶

3、菌酶可把細胞壁上的肽聚糖水解，以利侵入。頭部的核酸迅速即通過尾管以利侵入。頭部的核酸迅速即通過尾管及其末端小孔注入宿主細胞中，并將蛋及其末端小孔注入宿主細胞中，并將蛋白質軀殼留在壁外。從吸附到侵入的時白質軀殼留在壁外。從吸附到侵入的時間極短，例如間極短，例如T4只需只需15s。3.增殖增殖：包括核酸的復制和蛋白質的生：包括核酸的復制和蛋白質的生物合成。首先，噬菌體一起核算中的遺物合成。首先，噬菌體一起核算中的遺傳信息向宿主細胞發出指令并提供傳信息向宿主細胞發出指令并提供“藍藍圖圖”，使宿主細胞的代謝系統按嚴密程，使宿主細胞的代謝系統按嚴密程序、有條不紊地逐一轉向或適度改造，序、有條不紊地逐一轉

4、向或適度改造，從而轉變成能有效合成噬菌體所特有的從而轉變成能有效合成噬菌體所特有的組分和組分和“部件部件”，其中所需，其中所需“原料原料”可可通過宿主細胞原有核酸等的降解、代謝通過宿主細胞原有核酸等的降解、代謝庫內的貯存物或從外界環境中取得。一庫內的貯存物或從外界環境中取得。一旦大批成套的旦大批成套的“部件部件”已合成，就在細已合成，就在細胞胞“工廠工廠”里進行突擊裝配，于是就產里進行突擊裝配，于是就產生了一大群形狀、大小完全相同的子代生了一大群形狀、大小完全相同的子代噬菌體。噬菌體。4.成熟（裝配）：成熟（裝配）：噬菌體的成熟過程事噬菌體的成熟過程事實上就是把已合成的各種實上就是把已合成的各

5、種“部件部件”進行進行自裝配的過程。在自裝配的過程。在T4噬菌體的裝配過程噬菌體的裝配過程中，約需中，約需30種不同蛋白質和至少種不同蛋白質和至少47個基個基因參與，其裝配過程主要步驟有：因參與，其裝配過程主要步驟有：DNA分子的縮合，通過衣殼包裹分子的縮合，通過衣殼包裹DNA而形成而形成完整的頭部，尾絲和尾部的其他完整的頭部，尾絲和尾部的其他“部件部件”獨立裝配完成，頭部和尾部相結合后，獨立裝配完成，頭部和尾部相結合后，最后再裝上尾絲。最后再裝上尾絲。5.裂解裂解：當宿主細胞內的大量子代噬菌：當宿主細胞內的大量子代噬菌體成熟后，由于水解細胞膜的脂肪酶和體成熟后，由于水解細胞膜的脂肪酶和水解細

6、胞壁的溶菌酶等的作用，促進了水解細胞壁的溶菌酶等的作用，促進了細胞的裂解，從而完成子代噬菌體的釋細胞的裂解，從而完成子代噬菌體的釋放。放。 噬菌體侵染過程如下：噬菌體侵染過程如下：噬菌體的侵染過程示意圖：噬菌體的侵染過程示意圖：噬菌體的侵染實驗的研究證明了噬菌體的侵染實驗的研究證明了DNA是遺傳物質是遺傳物質二、噬菌體展示及抗體庫技術二、噬菌體展示及抗體庫技術（一）噬菌體展示技術：（一）噬菌體展示技術： 1.展示技術的發展歷程展示技術的發展歷程 1985年年,Smith第一次成功第一次成功 地將地將EcoR核酸內切酶基核酸內切酶基 因插入絲狀噬菌體基因因插入絲狀噬菌體基因p 中中,并在噬菌體表

7、面表達出了并在噬菌體表面表達出了 融合的蛋白。融合的蛋白。 1990年年McCafferty等又在此基礎上構建了等又在此基礎上構建了庫容為庫容為106的抗體庫的抗體庫,并從中成功地篩選出并從中成功地篩選出了溶菌酶單鏈抗體后了溶菌酶單鏈抗體后,噬菌體抗體庫技術成噬菌體抗體庫技術成為了抗體工程中的一種新興的抗體制備的為了抗體工程中的一種新興的抗體制備的手段。手段。 近年來，隨著分子生物學的不斷發展近年來，隨著分子生物學的不斷發展,利用利用基因工程手段獲得基因工程抗體的方法成基因工程手段獲得基因工程抗體的方法成為抗體技術研究的熱點為抗體技術研究的熱點.2.噬菌體展示技術的簡介：噬菌體展示技術的簡介：

8、 是將外源蛋白或多肽的是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。到目前為止，人噬菌體表面的生物技術。到目前為止，人們已開發出了單鏈絲狀噬菌體展示系統、們已開發出了單鏈絲狀噬菌體展示系統、噬菌體展示系統、噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統等數噬菌體展示系統等數種噬菌體展示系統。種噬菌體展示系統。 3.噬菌體展示技術的原理：噬菌體展示技術的原理： 噬菌體展示技術

9、是將多肽或蛋白質的噬菌體展示技術是將多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。以利于靶分子的識

10、別和結合。 肽庫與固相上的靶蛋白分子經過一定肽庫與固相上的靶蛋白分子經過一定時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經過胞后經繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經過3輪輪5輪的輪的“吸附吸附-洗脫洗脫-擴增擴增”后，與靶分后，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。所得子特異結合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結合特性的目標噬菌體。結

11、合特性的目標噬菌體。 4.噬菌體展示系統：噬菌體展示系統： 單鏈絲狀噬菌體展示系統單鏈絲狀噬菌體展示系統 ： （1）P展示系統展示系統:絲狀噬菌體是單鏈絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，病毒，P是病毒的次要外殼蛋白，位于病是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個病毒顆粒都有所必須的。每個病毒顆粒都有3個個5個拷個拷貝貝P蛋白，其在結構上可分為蛋白，其在結構上可分為N1、N2和和CT 3個功能區域，這個功能區域，這3個功能區域由兩段富個功能區域由兩段富含甘氨酸的連接肽含甘氨酸的連接肽G1和和G2連接。連接。 其中，其中，N1和和

12、N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細胞膜有關，而毛及穿透細胞膜有關，而CT構成噬菌體外殼蛋白構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分，并將整個結構的一部分，并將整個P蛋白的蛋白的C端結構域錨端結構域錨定于噬菌體的一端。定于噬菌體的一端。P有有2個位點可供外源序列個位點可供外源序列插入，當外源的多肽或蛋白質融合于插入，當外源的多肽或蛋白質融合于P蛋白的蛋白的信號肽信號肽(Sg)和和N1之間時，該系統保留了完整的之間時，該系統保留了完整的P蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與蛋白直接與P蛋白的蛋白的CT結構域相連，則噬菌體結構域相連

13、，則噬菌體喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整菌體表達的完整P蛋白來提供。蛋白來提供。P蛋白很容易蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時，被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時，可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，即所謂即所謂“單價單價”噬菌體。噬菌體。（2）P及其他展示系統：及其他展示系統：P是絲狀噬菌是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側，體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側，C端端與與DNA結合，結合，N端伸出噬菌體外，每個病端伸出噬菌體外，每個病毒顆粒有毒顆粒

14、有2 700個左右個左右P拷貝。拷貝。P的的N端端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時，可提供野生型輔助噬菌體參與時，可提供野生型P蛋白，蛋白，降低價數，此時可融合多肽甚至抗體片段。降低價數，此時可融合多肽甚至抗體片段。 此外，尚有絲狀噬菌體此外，尚有絲狀噬菌體P展示系統的展示系統的研究報道。研究報道。P蛋白的蛋白的C端暴露于噬菌體表端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點，可以面，可以作為

15、外源蛋白的融合位點，可以用于研究外源蛋白用于研究外源蛋白C端結構區域功能。從所端結構區域功能。從所掌握的文獻來看，該系統主要用于掌握的文獻來看，該系統主要用于cDNA表表面展示文庫的構建，并取得了不錯的篩選面展示文庫的構建，并取得了不錯的篩選效果。效果。噬菌體展示系統：噬菌體展示系統： （1）PV展示系統：展示系統：噬菌體的噬菌體的PV蛋白構成了它的蛋白構成了它的尾部管狀部分，該管狀結構由尾部管狀部分，該管狀結構由32個盤狀結構組成，個盤狀結構組成，每個盤又由每個盤又由6個個PV亞基組成。亞基組成。PV有兩個折疊區域，有兩個折疊區域，C端的折疊結構域（非功能區）可供外源序列插端的折疊結構域（非

16、功能區）可供外源序列插入或替換。目前，用入或替換。目前，用PV系統已成功展示了有活性系統已成功展示了有活性的大分子蛋白的大分子蛋白-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（465 ku）和植物外）和植物外源凝血素源凝血素BPA（120 ku）等。）等。噬菌體的裝配在噬菌體的裝配在細胞內進行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質。細胞內進行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質。該系統展示的外源蛋白質的拷貝數為平均該系統展示的外源蛋白質的拷貝數為平均1個分個分子子/噬菌體，這表明外源蛋白質或多肽可能干擾了噬菌體，這表明外源蛋白質或多肽可能干擾了噬菌體的尾部裝配。噬菌體的尾部裝配。 （2）D蛋白展示系統：蛋白展示系統：D蛋白

17、的分子質量為蛋白的分子質量為11 ku，參與野生型，參與野生型噬菌體頭部的裝配。噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當突變型噬菌體基因組突出在殼粒表面。當突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的小于野生型基因組的82%時，可以在缺少時，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。在空間上是可以接近的。 病毒顆粒的組裝可以在體內也可以在病毒顆粒的組裝可以在體內也可以在體外，體外組裝即是將體外，體

18、外組裝即是將D融合蛋白結合到融合蛋白結合到D-噬菌體表面，而體內組裝是將含噬菌體表面，而體內組裝是將含D融合融合基因的質粒轉化入基因的質粒轉化入D-溶源的大腸埃希菌菌溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補償溶源菌所缺的種中，從而補償溶源菌所缺的D蛋白，通過蛋白，通過熱誘導而組裝。該系統有一個很好的特點，熱誘導而組裝。該系統有一個很好的特點，噬菌體上融合蛋白和噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿蛋白的比例可以由宿主的抑制主的抑制tRNA活性加以控制，這對于展示活性加以控制，這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質時特別有用。時特別有用。 T4噬菌體展示系統噬菌

19、體展示系統 ： T4噬菌體展示系統是噬菌體展示系統是20世紀世紀90年代中年代中期建立起來的一種新的展示系統。它的顯期建立起來的一種新的展示系統。它的顯著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源多肽或蛋白質，分別與多肽或蛋白質，分別與T4衣殼表面上的外衣殼表面上的外殼蛋白殼蛋白SOC（9 ku）和）和HOC（40 ku）融）融合而直接展示于合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它噬菌體的表面，因此它表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化，避免表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細胞內裝配，

20、不需通過分噬菌體是在宿主細胞內裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質，很少受到限制。白質，很少受到限制。 吳健敏等成功地將大小約吳健敏等成功地將大小約215 aa SOC/m E2融合蛋白展示于融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面。令人值得關噬菌體衣殼表面。令人值得關注的是，注的是，SOC與與HOC蛋白的存在與否，并不影響蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。的生存和繁殖。SOC和和HOC在噬菌體組裝時可在噬菌體組裝時可優于優于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實上，的包裝而裝配于衣殼的表面，事實上，在在DNA包裝被抑制時，包裝被抑制時，T

21、4是雙股是雙股DNA噬菌體中唯噬菌體中唯一能夠在體內產生空衣殼的噬菌體（一能夠在體內產生空衣殼的噬菌體（SOC和和HOC也同時組裝）。因此，在用重組也同時組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時，它做疫苗時，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。景。 T7噬菌體展示系統：噬菌體展示系統： T7噬菌體噬菌體是烈性噬菌體。是烈性噬菌體。具有兩具有兩個雙鏈臂個雙鏈臂,外源基因可插入雙臂間外源基因可插入雙臂間,經體經體外包裝后可直接侵染大腸桿菌外包裝后可直接侵染大腸桿菌,獲得

22、抗獲得抗體庫體庫,目前應用也較為廣泛。目前應用也較為廣泛。 T7噬菌體的優點：噬菌體的優點：1.生長迅速。生長迅速。2.可表達可表達大于大于50個氨基酸的多肽片段而個氨基酸的多肽片段而不需要輔助不需要輔助噬菌體噬菌體進行包裝。進行包裝。3.可可高拷貝地表達高拷貝地表達約約50個氨基酸的多肽片段或低拷個氨基酸的多肽片段或低拷貝地表達貝地表達1000個氨基酸的多肽片段。個氨基酸的多肽片段。4.在高在高PH值，高鹽、變性劑等條件下十分值，高鹽、變性劑等條件下十分穩定穩定，有，有利于根據不同需要采用多種條件進行篩選，而利于根據不同需要采用多種條件進行篩選，而不不影響影響噬菌體本身噬菌體本身活性活性。

23、5.噬菌體展示技術的噬菌體展示技術的局限性局限性 ：（1）在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、）在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、噬菌體包裝，有的展示系統還要經過跨膜噬菌體包裝，有的展示系統還要經過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數量一般限制文庫中含有不同序列分子的數量一般限制在在109。 （2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質功能的實現需要折疊、轉表達，因為有些蛋白質功能的實現需要折疊、

24、轉運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗中，由于擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗中，由于部分未折疊的蛋白在細菌中很容易被降解，因此，部分未折疊的蛋白在細菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達差，也是體內選擇壓力的一個例子。真核細胞蛋差，也是體內選擇壓力的一個例子。真核細胞蛋白在細菌中表達差是因為它們的蛋白質合成與折白在細菌中表達差是因為它們的蛋白質合成與折疊機制

25、不同的緣故。疊機制不同的緣故。 （3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。中分子遺傳的多樣性。 （4）由于噬菌體展示系統依賴于細胞內基因）由于噬菌體展示系統依賴于細胞內基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。示。 （二）噬菌體抗體庫技術：（二）噬菌體抗體庫技術： 1.簡介：簡介： 噬菌體抗體庫技術是指利用分子生物噬菌體抗體庫技術是指利用分子生物學手段將外源學手

26、段將外源DNA片段插入噬菌體基因片段插入噬菌體基因,與與編碼噬菌體外殼蛋白的基因相連接編碼噬菌體外殼蛋白的基因相連接,通過侵通過侵染宿主染宿主,在噬菌體表面表達成融合蛋白的過在噬菌體表面表達成融合蛋白的過程經過對目標分子如蛋白、糖蛋白、病毒程經過對目標分子如蛋白、糖蛋白、病毒及小分子物質等的特異性結合篩選過程及小分子物質等的特異性結合篩選過程,從從而富集得到針對的目標分子的噬菌體展示而富集得到針對的目標分子的噬菌體展示抗體的技術?？贵w的技術。 2.噬菌體抗體庫的分類噬菌體抗體庫的分類 (1)根據根據 免疫抗體庫免疫抗體庫 插入基插入基 因片段因片段 非免疫抗體庫非免疫抗體庫 天然抗體庫天然抗體

27、庫 的來源的來源 半合成抗體庫半合成抗體庫 全合成抗體庫全合成抗體庫 (2)根據可利用的載體主要分為根據可利用的載體主要分為: 絲狀噬菌體展示絲狀噬菌體展示 （M13為最常用）為最常用） 噬菌體展示噬菌體展示 T4噬菌體展示噬菌體展示 T7噬菌體展示噬菌體展示 具體內容如下：具體內容如下：絲狀噬菌體是一種分泌型噬菌體。是單鏈環狀絲狀噬菌體是一種分泌型噬菌體。是單鏈環狀DNA病毒，其含有五種結構蛋白：病毒，其含有五種結構蛋白： 主要衣殼蛋白主要衣殼蛋白p8 4種次要衣殼蛋白種次要衣殼蛋白p3、p6、p7和和P9。絲狀噬菌體展示外源性基因，有兩種形式：絲狀噬菌體展示外源性基因，有兩種形式： 噬菌噬

28、菌體體載體載體 噬菌噬菌粒粒載體載體 3.目標抗體的篩選目標抗體的篩選 ： 工程抗體的體外成熟對醫療領域具有工程抗體的體外成熟對醫療領域具有重要的作用重要的作用,通過噬菌體抗體庫的篩選是抗通過噬菌體抗體庫的篩選是抗體體外成熟的其中一種方式體體外成熟的其中一種方式,通過不斷地篩通過不斷地篩選選,從而促使陽性克隆不斷地富集。從而促使陽性克隆不斷地富集。 最常見的篩選方法包括固相篩選、生最常見的篩選方法包括固相篩選、生物素篩選和液相篩選等。物素篩選和液相篩選等。Burmester等構等構建了青霉素免疫單鏈抗體庫建了青霉素免疫單鏈抗體庫,并利用免疫試并利用免疫試管包被管包被transferrin-EM

29、CS-ampicillin進行進行抗體的篩選?？贵w的篩選。Yuan等從等從7個不同的人種個不同的人種,共共47個健康人類的血液中提取基因個健康人類的血液中提取基因,構建了人構建了人源天然源天然scFv噬菌體抗體庫噬菌體抗體庫,并利用細胞篩選并利用細胞篩選的方法獲得的方法獲得anti-MISIIR單鏈抗體分子。單鏈抗體分子。 4.目標抗體的表達：目標抗體的表達： 外源基因的克隆表達主要有兩種途徑外源基因的克隆表達主要有兩種途徑,即原核表達及真核表達即原核表達及真核表達,原核表達主要是通原核表達主要是通過大腸桿菌進行表達過大腸桿菌進行表達,真核表達主要是通過真核表達主要是通過酵母菌進行表達酵母菌進

30、行表達,如畢赤酵母菌如畢赤酵母菌;噬菌體展示噬菌體展示抗體的表達多是通過各種不同的抗體的表達多是通過各種不同的E. coil菌菌種進行表達種進行表達,如如HB2151、pMF3、pHOG-21。 5.噬菌體抗體庫的應用：噬菌體抗體庫的應用： 噬菌體展示抗體的應用已逐漸深入抗噬菌體展示抗體的應用已逐漸深入抗體工程的多個領域如醫療制藥、基于體工程的多個領域如醫療制藥、基于ELISA技術的食品和環境的安全檢測及蛋技術的食品和環境的安全檢測及蛋白質相互作用等。白質相互作用等。在醫療制藥方面的研究應用在醫療制藥方面的研究應用 ： 對老年癡呆癥、狂犬病對老年癡呆癥、狂犬病 、抗腫瘤藥物、抗腫瘤藥物載體載體

31、 、SARS 、HIV、肝炎、結核病等疾、肝炎、結核病等疾病方面都有很大的幫助。病方面都有很大的幫助。在食品環境檢測中的研究應用在食品環境檢測中的研究應用 ： Zhao等利用噬菌體抗體庫成功篩選得等利用噬菌體抗體庫成功篩選得到了低分子量環境毒素到了低分子量環境毒素-微囊藻毒素的目標微囊藻毒素的目標抗體抗體,為環境中小分子毒素的研究提供了新為環境中小分子毒素的研究提供了新的途徑。的途徑。 Li等以等以pCANTAB5E為噬菌體載體為噬菌體載體,構構建了甲胺磷的小鼠免疫抗體庫建了甲胺磷的小鼠免疫抗體庫,利用利用ELISA的方法篩得了三個陽性克隆并進行了可溶的方法篩得了三個陽性克隆并進行了可溶性表達

32、。性表達。 Brichta等利用天然噬菌體抗體庫對等利用天然噬菌體抗體庫對2, 4-D除草劑進行了篩選研究。除草劑進行了篩選研究。在蛋白質與蛋白質相互作用方面的研在蛋白質與蛋白質相互作用方面的研究應用：究應用： Smith等利用噬菌體抗體庫技術獲得等利用噬菌體抗體庫技術獲得4-乙酰氨基苯酚的親和肽乙酰氨基苯酚的親和肽,對低分子量蛋白質對低分子量蛋白質之間的相互作用進行了相應的研究之間的相互作用進行了相應的研究,為傳感為傳感器的研究提供了實驗依據。器的研究提供了實驗依據。 孔波等利用孔波等利用pHEN1-KM13噬菌體展示噬菌體展示系統表達了融合的谷胱甘肽系統表達了融合的谷胱甘肽S轉移酶轉移酶,并