1、    赤靈芝孢子粉對環孢素A免疫抑制模型小鼠固有免疫功能的影響作者：蔣催蓉， 左 麗， 鐘志強 作者單位：(貴陽醫學院 免疫學教研室，貴州 貴陽 550004)【摘要】 目的： 探討赤靈芝孢子粉對環孢素A免疫抑制小鼠固有免疫功能的影響。方法： 用不同劑量赤靈芝孢子粉對環孢素A模型小鼠灌胃, 于停藥后第2、20天分別檢測小鼠腹腔巨噬細胞和中性粒細胞的吞噬功能、免疫器官重量及血清總補體活性(CH50)。結果： 與模型空白對照組比較，停藥后第2天，高、中、低均可顯著提高環孢素A小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力和胸腺指數，P<0.05,血清CH50值以中劑量組

2、提高顯著(P<0.05);停藥后第20天，巨噬細胞的吞噬能力以中劑量組增強明顯(P<0.05)，血清CH50以高劑量組提高顯著(P<0.05)，胸腺指數以低劑量組提高明顯(P<0.05)。結論： 赤靈芝孢子粉可增強環孢素A免疫抑制模型小鼠的固有免疫功能。【關鍵詞】 靈芝屬; 免疫抑制; 模型，動物; 吞噬細胞; 吞噬作用Effect of Ganoderma lucidum spore on Innate Immunity ofImmunosuppression Mice Induced by Cyclosporin AJIANG Cuirong， ZUO Li， ZH

3、ONG Zhiqiang(Department of Immunology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，Guizhou, China)Abstract Objective: To investigate the immunoregulation effect of Ganoderma lucidum spore powder in immunosuppression mice induced by cyclosporin A (CsA). Methods： Different dosages of G. lucidum spore were g

4、iven orally to CsA immunosuppression model mice, and the phagocytic function of macrophage and neutrophile, total hemolytic complement(CHSO), weight of immune organs of the experimental mice were detected on the 2nd and 20th days after the withdrawal. Results： In mice of high, middle, and low dosage

5、 subgroups of G. lucidum spore treated group on the 2nd day of withdrawal, the phagocytic rates of macrophages,and the thymus indexes were significantly higher than those in mice of control group (P<0.05), and the serum CH50 significantly increased in the middledosage subgroup (P<0.05). Compar

6、ed with the test results of control group, on the 20th day after withdrawal, the phagocytic rates of the macrophages increased remarkably in middledosage subgroup, the serum CH50 was promoted significantly in highdosage subgroup (P<0.05), and the thymus index increased greatly in lowdosage subgro

7、up (P<0.05). The phagocytosis of neutrophil, and the spleen index were promoted on the 2nd and 20th days after withdrawal. Conclusion： Ganoderma lucidum spore can enhance the innate immunity of CsA immunosuppression model mice.Key words gardenia; immunosuppression; models, animal; phagocytes; pha

8、gocytosis環孢素A (Ciclosporin A， CsA) 是臨床上廣泛應用的一種免疫抑制劑，主要用于自身免疫性疾病和移植排斥反應的防治1,2。破壁赤靈芝孢子粉是延年益壽的營養食品，現代醫學研究發現它對老年常見病,如慢性支氣管炎、神經衰弱、肝炎、糖尿病等具有療效，并且具有抗癌、抗衰老等作用3。目前，國內外采用CsA建立免疫抑制小鼠模型的實驗研究極少，2006年9月2007年2月觀察靈芝孢子粉對環孢素A致免疫抑制成年模型小鼠固有免疫功能的恢復是否有積極作用，旨在為靈芝孢子粉的臨床應用提供依據。1 材料與方法1.1 實驗動物清潔級BALB/c小鼠100只，68周齡，體重(20±

9、2)g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號SCXK(滬)2003-0002。1.2 藥物來源2036/愛靈生樂牌破壁靈芝孢子粉膠囊，0.3 g/粒，為全破壁赤靈芝，由廣州寶興生物科技有限公司提供，批號為G20090069。環孢素注射液，由Novartis制藥公司提供，進口注冊號H20020228，批號為S00500，為濃縮注射液，5 ml/支。1.3 主要試劑及儀器白色葡萄球菌菌液按常規方法配制，瑞特氏染液， Nikon TS100F型倒置顯微鏡，METTLER TOLEDO型電子精密天平， SHIMADZU UV1700型紫外分光光度儀。1.4 動物分組及給藥100只小鼠隨機分為2批，

10、分別用于停藥后第2天及第20天實驗，再將每批動物隨機分為5組，赤靈芝孢子粉高劑量組(HD)、中劑量組(MD)和低劑量組(LD)及正常對照組(NC)、抑制模型空白對照組( IC)，每組10只(雄雌鼠各半)。除NC外的其余組均給予CsA 6 mg/(kg·d)，連續腹腔注射給藥7 d，腹腔注射容積為2.5 ml/100 g，完成免疫抑制小鼠模型的建立。停藥適應性喂養1 d后，給予赤靈芝孢子粉，用研磨器研碎、無菌蒸餾水溶解后灌胃。HD、MD和LD分別為1.2、0.6、0.3 g/(kg·d)。灌胃容積2 ml/100 g，每天1 次，連續灌藥18 d，NC、IC分別給予等體積雙蒸

11、水。于停藥后第2、20天分別進行檢測。1.5 吞噬功能的測定Hanks液3 ml，讓小鼠活動10 min后，腹腔內注射1% 雞紅細胞混懸液1 ml。3045 min后取腹腔液涂于載玻片，待自然干燥后瑞特氏染色，油鏡下計數100個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的數量, 計算吞噬率。1.6 胸腺指數、脾指數 各組小鼠稱體重，斷頸處死小鼠，分別取胸腺和脾臟，電子天平稱重，計算胸腺指數、脾指數。小鼠胸腺(或)脾指數=胸腺脾臟(或)重量(mg)/體重(g)。1.7 CH50溶血活性測定 取各組小鼠血清，做不同稀釋,加入致敏紅細胞在37 水浴孵育30 min后，2 500 r/min離心5 min，分光光度計( 5

12、42nm) 讀A542 nm，測出與50 % 溶血管最接近管值，CH50(U/ml)=1/引起50%溶血管血清量(ml) × 稀釋倍數。1.8 統計學處理 實驗數據均采用SPSS 11.5軟件包進行統計分析，統計方法采用單因素方差分析，LSD法或SNK法，方差不齊時采用TamhaneT2法，t 檢驗,所有結果用(x± s)表示,P<0.05表示差異有統計學意義。2 結果2.1 吞噬細胞吞噬功能從表1可見，與IC相比，停藥后第2天，LD組、MD組及HD組，第20天MD組，赤靈芝孢子粉均可顯著提高CsA小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力(P<0.05)，且LD組與HD組、L

13、D組與MD組之間差異具有顯著性(P<0.05)，但對小鼠腹腔中性粒細胞的吞噬作用無顯著增強(P>0.05)。2.2 CH50從表2可見，不同濃度赤靈芝孢子粉處理的模型小鼠與IC組相比，CH50值均有不同程度的增高，停藥后第2和20天MD組及HD組增高明顯，并具有統計學差異(P<0.05);與NC組相比，IC組及HD組的CH50值在停藥后第2天降低明顯(P<0.05)。表1 赤靈芝孢子粉對實驗小鼠巨噬細胞、中性粒細胞吞噬功能的影響表2 赤靈芝孢子粉對實驗小鼠血清CH50值的影響注：(1)與IC組相比，P<0.05;(3)與NC組相比，P<0.05。2.3 小鼠

14、脾指數、胸腺指數與IC組相比，停藥后第2天赤靈芝孢子粉LD組、MD組、HD組可顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(P<0.05)，HD組提高脾指數作用顯著(P<0.05)，且LD組與HD組之間的胸腺指數的差異具有顯著性(P<0.05);停藥后第20天，胸腺指數以LD組增高明顯(P<0.05)，各組間脾指數無顯著差異(P>0.05);與NC組比較，IC組的胸腺指數在停藥后第2、20天仍較低，具有顯著差異(P<0.05)。見表3。表3 赤靈芝孢子粉對實驗小鼠脾指數及胸腺指數的影響注：(1)與IC組相比，P<0.05;(2)LD組和HD組比較，P<0.05

15、;(3)與NC相比，P<0.05。3 討論環孢素A(Cyclosporine, CsA)是由11 個氨基酸組成的環狀多肽，是土壤中一種真菌的活性代謝物。1978年英國首次將CsA應用于臨床腎移植，此后CsA又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植，均取得令人滿意的效果，明顯提高了移植病人的生存率。CsA作為一種高選擇性、強力的免疫抑制劑，可抑制細胞介導的反應發生4，包括同種異體免疫、遲發性皮膚過敏、實驗性過敏性腦脊髓炎、Freund氏佐劑性關節炎、GVHD以及T細胞依賴性抗體的產生。在細胞水平，環孢素抑制包括IL2、T細胞生長因子(TCGF)在內的淋巴因子的生成和釋放，可阻斷細胞周期G0

16、或G1期的休止淋巴細胞，并通過激活的T細胞來抑制抗原觸發的淋巴因子的釋放5。王儼等6發現CsA可以抑制小鼠Th17細胞的分化。靈芝孢子粉為靈芝實體成長過程中散發的孢子聚集而成，孢子內含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質、酶類等特殊成分，因此靈芝孢子在增強免疫、抑制腫瘤的藥效方面遠遠超過其母體靈芝7。目前，免疫抑制動物模型的建立多選用環磷酰胺8、糖皮質激素8等免疫抑制劑，本實驗選用臨床廣泛應用的免疫抑制劑CsA構建免疫抑制小鼠模型，旨在觀察2036/愛靈生樂牌全破壁赤靈芝破壁孢子粉對免疫抑制小鼠部分固有免疫學指標的影響，為靈芝孢子粉作為免疫功能恢復的輔助藥物提供實驗依據。單核吞噬系統是機

17、體固有免疫系統的重要組成部分，包括單核、巨噬細胞及中性粒細胞，它們能非特異性吞噬、清除侵入機體的病原微生物等異物。在對單核吞噬細胞系統調節作用方面，孫美芳8在靈芝孢子粉拮抗環磷酰胺毒副反應的研究中發現，靈芝孢子粉對環磷酰胺引起的小鼠巨噬細胞吞噬能力減弱有明顯拮抗作用。任瑋等9實驗表明，靈芝孢子粉可顯著增強糖皮質激素免疫抑制模型小鼠的巨噬細胞吞噬功能。本實驗采用CsA建立免疫抑制小鼠模型，赤靈芝孢子粉低、中、高劑量都能明顯提高CsA免疫抑制摸型小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬清除能力(P<0.05)。補體系統廣泛參與機體抗微生物防御反應以及免疫調節作用，是機體固有免疫的重要組成部分。本實驗

18、顯示，中、低劑量的赤靈芝孢子粉對CsA模型小鼠的CH50值均有不同程度的增強作用，但模型空白組的血清總補體溶血活性仍較低(P<0.05)，高劑量赤靈芝孢子粉組的CH50值停藥后第2天降低顯著，停藥后第20天明顯升高(P<0.05)，提示停藥后第2天和20天赤靈芝孢子粉高、中、低劑量可顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數，高劑量組的脾指數于停藥后第20天提高顯著(P<0.05)，表明2036/愛靈生樂牌破壁赤靈芝孢子粉對CsA免疫抑制小鼠的固有免疫功能有提高作用。【參考文獻】1Leonardi S, Marchese G, Rotolo N,et al. Cyclosporin is safe and effective in severe atopic dermatitis of childhood, report of three cases J.Minerva Pedia