1、    血管肽對離體大鼠血管平滑肌細胞增殖和c-myb mRNA表達的影響        【摘要】目的觀察了血管肽(angiopeptim，AP)對血小板源性生長因子刺激下離體大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和c-myb mRNA表達的影響，從分子生物學水平探討其抗增殖作用機制。方法采用細胞計數確定VSMC增殖狀態。以Nothern印跡法測定c-myb mRNA表達水平。結果各組細胞計數分別為(5.45±0.57)×104，對照組；(4

2、.12±0.13)×104,30 nmol/L；(3.13±0.20)×104,60 nmol/L和(2.03±0.05)×104，120 nmol/L；(q=10.50,10.32和27.01，P<0.01)。抑制率分別為29%，52%和77%。其對VSMC c-myb mRNA表達的抑制也具劑量依賴性。c-myb mRNA/GAPDH比值分別為1.12±0.02(對照組)；0.61±0.01,30 nmol/L;0.34±0.01,60 nmol/L和0.16±0.01,120 nmo

3、l/L;q=39.23,60.00和73.85,P<0.01)。結論血管肽顯著抑制VSMC增殖及c-myb原癌基因表達，作用呈劑量依賴性。提示AP抗增殖作用與抑制晚期生長調節基因表達有關。【關鍵詞】血管平滑肌細胞； 血管肽； 癌基因Effects of angiopeptin on expression of c-myb mRNA in rat vascular smooth muscle cellsXi Yongan, Wang Lihui, Tang Chaoshu.(Department of Cardiology, First Hospital of Beijing Medica

4、l University, Beijing 100034)【Abstract】ObjectiveOncogenes play an important role in cell growth and differentiation. Angiopeptin (AP) has been shown to be a potent antiproliferative agent for various cell types. The mechanism of AP on the VSMC proliferation is unclear. The aim of this study was to a

5、nalyze the effects of AP on proliferation and expression of c-myb protooncogene in cultured rat VSMC treated with platelet-derived growth factor (PDGF). MethodsCell proliferation was determined by cell counting. The expression of c-myb mRNA of VSMC was detected by Northern blot. ResultsAP produced a

6、 dose-dependent inhibition of VSMC proliferation compared with control group. The number of VSMC were (5.45±0.57)×104 (for control group, ±s)； (4.12±0.13)×104, 30 nmol/L； (3.13±0.20)×104, 60 nmol/L; and (2.03±0.05)×104， 120 nmol/L；(q=10.50, 10.32 and 27.0

7、1; P<0.01) respectively. The inhibitory rates were in turn 29%， 52% and 77%, compared with control group. The c-myb mRNA expression of VSMC was also inhibited by AP in a dose-dependent manner. The relative densitometric units were 1.12±0.02 (for control); 0.61±0.01, 30 nmol/L; 0.34±

8、;0.01, 60 nmol/L and 0.16±0.01, 120 nmol/L; (q=39.23, 60.00, and 73.85; P<0.01). ConclusionsAP strongly inhibits both VSMC proliferation and c-myb mRNA expression, suggesting that the mechanism of AP on VSMC proliferation is related to suppressing the late growth regulated gene expression.【K

9、ey words】Smooth muscle cells; Angiopeptin; Oncogene血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和表型改變是動脈粥樣硬化及其他閉塞性血管疾病的主要病理基礎1。血管肽(angiopeptin,AP)系一人工合成環八肽生長激素釋放抑制因子類似物，對多種細胞具有抗增殖作用，并能抑制大鼠，家兔，豬和非人靈長類血管內皮損傷后肌內膜增殖2。其作用機理尚不完全清楚，一般認為與抑制VSMC活化所需生長因子有關。新近，AP對VSMC增殖基因表達的影響受到學者們關注。有證據表明，AP能抑制損傷家兔動脈c-fos和c-jun的表達。迄今，AP對c-myb mRNA表達的作用尚少報

10、道。為此，我們探討了AP對血小板源性生長因子(PDGF)刺激的體外大鼠胸主動脈VSMC表達c-myb mRNA的作用，從分子生物學角度研究AP抗細胞增殖的作用機理。材料與方法一、細胞培養選用6周齡雄性SD大鼠活殺，取胸主動脈中膜以貼塊法培養于含10%胎牛血清(FCS,GIBCO產品)，20 mmol/L HEPES(Sigma產品)，2 mmol/L L-谷氨酸，100 IU/ml青霉素，100 g/ml鏈霉素的DMEM培養基中，置培養箱(37)培養。待細胞半融合后以0.01%胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞進行實驗處理。二、細胞增殖抑制分析單細胞懸液種植于含2.5%FCS-DMEM 24孔培養

11、板中(5×103細胞/孔)，24 h后換含PDGF及不同劑量AP(HBI-USA惠贈)的2.5%FCS-DMEM培養基，每劑量組4孔。對照組以PBS代替AP。于第4日行酶消化懸浮細胞，以計數板進行細胞計數。每孔重復4次，以均值行統計分析。三、c-myb mRNA表達分析1.細胞同步與AP應用：VSMC種植于含2.5%FCS-DMEM的150 mm組織培養皿中(Falcon Labware產品)，每皿9×105細胞。采用血清饑餓法同步細胞，即4 h后換0.1%FCS-DMEM。4日后換2.5%FCS-DMEM。換液前1 h,各皿分別加入AP(30,60和120 nmol/L)

12、與PDGF(30 ng/mL)。每2 h補加等量AP一次，14 h收獲細胞。對照組以等量PBS代替AP。2.RNA提取與Northern印跡，雜交：采用異硫氰酸胍一步法提取細胞總RNA，紫外分光光度計定量，行1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，每泳道上樣20 g,按標準方法轉于尼龍膜(GIBCO產品)。以隨機引物法標記v-myb,GAPDH探針，所用試劑盒為Promega產品。10%硫酸葡聚糖，40%甲酰胺，42雜交16 h,標準SSC洗膜，于-70行放射自顯影。進行光密度掃描分析。四、統計學分析資料以±s表示，行Newman-Keuls檢驗分析。結果一、AP對VSMC增殖的抑制作用觀察了不

13、同劑量AP對PDGF刺激下VSMC增殖的抑制作用。結果表明，AP能顯著抑制VSMC增殖，作用呈劑量依賴性。抑制率分別為29%(30 nmol/L),52%(60 nmol/L)和77%(120 nmol/L)(1)。高劑量時(120 nmol/L)細胞依然鋪展，未見細胞死亡，表明細胞處于靜止狀態。二、AP對VSMC c-myb mRNA表達的影響為探討AP抗增殖作用的分子生物學機制，本研究觀察了AP對VSMC c-myb mRNA表達的作用。結果表明，AP能明顯抑制VSMC c-myb mRNA的表達，作用呈劑量依賴性(表1，2)。提示，AP對VSMC增殖的抑制作用至少部分與阻遏c-myb原癌

14、基因表達有關。表1AP對培養VSMC c-myb mRNA表達的作用(±s)分組mRNAGAPDHmrNA/GAPDH對照組29.3±80.51*26.27±0.06*1.12±0.02*AP1組(30 nmol/L)16.0±50.0626.40±0.110.61±0.01AP2組(60 nmol/L)8.94±0.0726.37±0.090.34±0.01AP3組(120 nmol/L)4.09±0.1226.34±0.130.16±0.01*與其他組比較P&l

15、t;0.01，*與其他組比較P>0.05 討論AP為生長激素釋放抑制因子樣肽類家系成員之一，晚近被開發用作防止肌內膜增殖的新制劑3。最初發現AP能抑制淋巴細胞增生，推測其具有免疫抑制功能。隨后研究證實AP對多種腫瘤細胞也有同樣效應。新近，其抗增殖作用已擴展至抑制VSMC增殖和動脈外植塊的3H摻入4。其抗增殖作用機理尚不清楚，推測AP與細胞表面受體結合能產生抑制信號或阻止G1期中期關鍵絲裂原衍生信號的正常傳號。AP能進入VSMC，有可能防止諸如胰島素樣生長因子-1,表皮生長因子，成纖維細胞生長因子的合成與釋放。AP能減少生長因子受體表達，如血管緊張素,后者為VSMC增生，肥大的促進物及PD

16、GF的協同劑。最近發現，AP尚能減少VSMC表面血管緊張素受體5。AP抑制早期即刻反應原癌基因如c-fos,c-jun的表達，它們編碼與生長因子有關的轉錄調節子，促進導致肌內膜肥厚的VSMC增殖與細胞外基質分泌。AP也可能通過上調受體而增加生長因子表達。c-myb原癌基因同源于禽類髓母細胞瘤病毒轉化基因，在細胞分化增殖中起關鍵作用6。本研究AP對PDGF刺激下大鼠離體培養VSMC c-myb mRNA表達的作用。結果表明，AP顯著抑制PDGF刺激的VSMC增殖，作用呈劑量依賴性。AP對VSMC c-myb mRNA表達也具有同樣效應。提示，AP可能通過抑制G1期中期關鍵mRNA產生而發揮其抗增

17、殖作用。如果受抑mRNA系隨后細胞周期演進所必需，那么G1期中期相應基因表達不足就可能導致細胞生長受抑。(本文編輯:常青)本課題為國家自然科學基金資助項目郗永安（天壇醫院CCU工作）汪麗蕙（北京大學第一醫院心內科100034）唐朝樞（北京大學第一醫院心內科100034）參考文獻1，Miano JM, Tota RR, Viasic N, et al. Early protooncogene expression in rat aortic smooth muscle cells following endothelial removal. Am J Pathol, 1990,137:761-7

18、65.2，Santoian EC, Schneider JE, Gravanis MB, et al. Angiopeptin inhibits intimal hyperplasia after angioplasty in porcine coronary arteries. Circulation, 1993,88:11-14.3，Howell MH, Adams MM, Wolfe MS, et al. Angiopeptin inhibition of myointimal hyperplasia after balloon angioplasty of large arteries in hypercholesterolaemic rabbits. Clinical Science, 1993,85:183-188.4，Foegh ML, Asotra S, Conte JV, et al. Early inhibition of myointimal proliferation by angiopeptin after balloon catheter injury in the rabbits. J Vasc Surge, 1994,10:1084-1091.5，Diglio CA