1、1.1.1 Gibson assembly簡介(INTRODUCTION)原理：Gibson assembly是一種one step, one pot 的快速基因組裝 方法。它只需要將基因片段和需要的三種酶混合在同一個管內在50 C下培養15-60 min就可以得到組裝好的 DNA裝配原理基于DNAt段間的重疊區域，過程依賴于三種酶：DNA外切 酶(T5 exonuclease),高保真 DN膘合酶。(Phusion polymerase) 和耐熱DN旌接酶(Taq DNAigase )的共同作用。首先，T5核酸 外切酶消化DNA片段的鏈 方向是從5到3.每個DNAt段分別 形成一個單鏈的突出

2、部分，由于著這兩個相鄰的突出片段有一部分具 有同源性能夠互補，所以 DNAt段退火，互補的序列重新配對連接。然后，在空缺的部分DN膘合酶以另一條DN嬋鏈為模板，沿3方 向將對應的脫氧核甘酸連接到單鏈上，填補缺口。最后，連接酶將兩Gaboon Assembly0K rWE如 Ell.Full,寓濟*面。2d mAAdd k/Jgll% LuGibwn AssemblyMaster Mi宣incubate 聞 50pClo-i 15-60 mrillesOiA ou xulan曲a條DNA單鏈黏合起來，密封裂縫。這樣具有重疊區域的DNAt段就組裝成一整條DN砌子了。下面是組裝的示意圖 材料（MAT

3、ERIALS）試劑（REAGENTSNAD H2O ,1 M MgC2, 1 M DTT； 10 mM dNTP mix 1 M Tris-HCl pH , 50% PEG-8000 mg/ mL Tag ligase , g/ mL T5_ExO, Phusion（1 X）、LB培養基、抗生素（據載體而定）、LB平板（相應 抗性）實驗前準備（SETUP于冰水浴中配制如下反應體系。如果不慎將液體粘在管壁，可通 過短暫離心使其沉入管底。4x isothermal assembly buffer20NAD mgH2O300 pL1MMgC2300 pL1MDTT300 pL10mMdNTPmix

4、600 pL1 M Tris-HCl pH3mL50% PEG-80003 mL加水到mL,每管分500 pL存于-20 C或-80 C冰箱，夠3000 個反應2x assembly mix: best combination:100reaction1 mLmg/mLTag ligase10 pLwg/ mL T5_ExO100i LPhusion(1 x)25 pL4X.buffer500 口加水365 pL,存于-20 C冰箱，有效期1年。實驗步驟( PROCEDURE1 .設計引物通過PCR勺方法在DNAt段的兩端加上同源片段，NEBH 薦同源片段的長度為15-40 bp,同時要求這部分

5、對應的退火溫度 高于4 C2 .進行DNA屯化：PCFT物進行瓊脂糖電泳，膠回收。或者PCFT物 回收試劑盒回收。3 .進行重組反應，以20 pL反應體系為例：組分加入量Isothermal assembly Master Mix 10 L線性化載體10-100ng (1- 2 pL)8-補足至插入片段（3- 5X載體）Sterilized ddH 2O20 口50 C 反應 15-60 min4 .反應產物轉化、涂板及克隆鑒定同傳統分子克隆方法。針對性建議1 .在選擇克隆位點時，應避免選擇克隆位點上下游50 bp內有重復序列的區域。當克隆位點上下游 20 bp區域內GC含量士在40%- 60施圍之內時，重組效率將達到最大。如這部分區域GC含量高于70%g者低于30%重組效率會受到較大影響。2 . Gi