1、鹿茸多肽對淀粉樣蛋白誘導脊髓神經元細胞凋亡的保護作用 作者：王旭凱 王英 楊有庚 冷向陽【摘要】 目的探討鹿茸多肽對淀粉樣蛋白誘導脊髓神經元細胞凋亡的保護作用。方法體外進行胎鼠脊髓神經元細胞培養傳代，細胞進入對數生長期后進行實驗。MTT比色法檢測不同濃度淀粉樣蛋白作用24 h后細胞活力變化；檢測25molL 淀粉樣蛋白作用24 h后，細胞凋亡百分數和觀察細胞caspase3表達情況。結果不同濃度的淀粉樣蛋白作用24 h后對細胞活力均明顯下降，并呈劑量依賴性(P0.05)；鹿茸多肽可明顯抑制淀粉樣蛋白誘導的脊髓神經元細胞凋亡現象(P0.05)，且可使caspase3的表達量下降。結論鹿茸多肽通過

2、抑制淀粉樣蛋白誘導脊髓神經元細胞caspase3表達增高而對其細胞凋亡發揮保護作用，本實驗為探索新的脊髓神經損傷的藥物提供了重要的理論基礎。 【關鍵詞】 鹿茸多肽 脊髓神經細胞 細胞凋亡 淀粉樣蛋白 casepase3脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是外科常見的創傷，其年發病率逐年升高。在脊髓損傷中，除了原發的物理打擊因素造成神經細胞損傷外，已發現損傷區及臨近部位的神經細胞存在遲發性的死亡現象，這種死亡與常見的壞死不同1，表現為一種程序性死亡（細胞凋亡），細胞凋亡可能參與了脊髓損傷的病理生理過程。caspase3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，降低其的表達有助于脊髓損傷的修

3、復和再生2。鹿茸系鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角3。關于鹿茸多肽混合物，近兩年，有學者通過實驗證明鹿茸多肽對脊髓損傷后的神經細胞有保護作用4，本實驗應用鹿茸多肽作用于淀粉樣蛋白誘導的脊髓神經元細胞凋亡的保護作用，以進一步闡述其對脊髓神經細胞保護作用的機理。1 實驗材料與方法1.1 實驗材料 15d孕鼠購自吉林大學實驗動物中心；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自invitrogen公司；細胞培養瓶和培養板購自Castar公司；神經生長因子（NGF）購自Sigma公司；鹿茸多肽由長春中醫藥大學惠贈；淀粉樣蛋白(A25-35)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自

4、(Sigma公司)；兔多克隆caspase3抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。1.2 實驗方法1.3 統計方法 應用統計分析軟件SPSS14.0分析數據，數據以均數標準差(xs)表示，兩兩比較采用t檢驗，P0.05，有統計學意義。1 2 結果2.1 脊髓神經元細胞的培養及鑒定 單細胞懸液接種后第2d，細胞聚集成團狀，第3d出現大量懸浮的neurosphere(約3060個細胞)，而且neurosphere越來越多。到第7d細胞胞體十分飽滿，輪廓清晰，有的細胞可見明顯的鳥眼狀細胞核，也有的細胞伸出樹枝狀突起，突起相互連成。用神經元特異烯醇化酶(NSE)標記神經元。鏡下觀察，可見實驗組細胞胞體

5、飽滿，突起明顯并連成網狀。見圖1。圖1 烯醇化酶(NSE)標記神經元（略）2.2 MTT比色法檢測細胞活力 MTT檢測結果顯示，不同濃度的A25-35（0、5、10、20、25、30molL)作用24h后，均可引起細胞活力下降，并呈一定的劑量依賴性(P0.05)。本實驗選擇A25-35 25mol /ml劑量進行后續實驗，見圖2。圖2 MTT法檢測A25-35細胞活力的影響（略）表1 鹿茸多肽對A誘導脊髓細胞凋亡的抑制作用（略）圖3 鹿茸多肽對A誘導脊髓細胞凋亡的抑制作用（略）2.4 免疫組化檢測caspase3結果 caspase3陽性細胞胞質著棕色。結果顯示：對照組無caspase3陽性染

6、色的細胞；A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）組caspase3陽性細胞數減少，比單純A（25molL）組少，其作用與NGF陽性對照組比較無差異，鹿茸多肽對脊髓細胞凋亡具有抑制作用。見圖4。a 對照組b A組（25molL）c A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）d A（25molL）+NGF（20ng/ml）圖4 鹿茸多肽對A（25M）誘導脊髓神經元細胞caspase3的表達的影響（略）3 討論 脊髓損傷的是神經領域內一道尚未解決的難題，雖然人們采取了許多種方法促進損傷后的脊髓軸突再生修復，但存在許多限制因素，很難達到理想效果，許多學者進行了深入研究脊髓神經組織損傷后

7、再生不良，其重要原因是傷后繼發性損害不斷加重所致，而細胞凋亡是繼發性損傷的關鍵，抑制細胞凋亡是阻止或減少繼發性損傷，保護神經功能的治療所在。細胞凋亡相關基因包括：Caspases（半胱氨酸蛋白酶基因家族）、bcl2（B細胞淋巴瘤/白血病基因家族2）、p53等。Caspases家族對細胞，特別是神經元凋亡程序的啟動具有核心作用。它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征性改變密切相關的蛋白，又稱為死亡蛋白酶。迄今已發現14個家族成員，其中caspase3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路5。因此抑制caspase3的表達是成為探索的治療途徑

8、之一。淀粉樣蛋白是淀粉樣前體蛋白(APP)通過一定降解途徑產生的6，其主要的活性片段為A25-35，A25-35可誘導細胞凋亡，本實驗利用輻射誘導脊髓神經細胞凋亡，觀察鹿茸多肽對脊髓神經細胞凋亡后caspase3表達的影響。 本實驗結果顯示：應用A25-35誘導胎鼠脊髓神經元細胞凋亡后，在細胞中加400mg/ml鹿茸多肽后，通過MTT比色法檢測細胞活力、流式細胞儀檢測細胞凋亡數目和免疫組化觀察caspase3表達量下降，提示，鹿茸多肽具有抑制A25-35誘導脊髓神經細胞凋亡的作用，其作用是通過調控凋亡基因的表達，即caspase3表達下調而實現的。本實驗說明，鹿茸多肽主要是通過有效地降低死亡蛋

9、白酶caspase3的表達量，進而抑制脊髓神經元細胞的凋亡起到保護脊髓神經元細胞的作用。【】 1 Emery E, Aldana P, Bunge MB, et al. Apoptosis after traumatic human spinal cord injuryJ.Journal Of Neuosurgery,1998, 89(6): 911920.2 Springer JE,Azbill RD,Knapp PE, Activation of the caspase3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injuryJ. Nature Medicine,1999, 5（8): 943946.3 王本祥,周秋麗.鹿茸的化學、藥理及臨床研究進展J. 藥學學報,1991, 26(9) : 714720.4 冷向陽.鹿茸多肽對輻射誘導脊髓神經細胞凋亡的保護作用J.實驗診斷學,2007,11(3):319321.5 Daigle I, Simon HU.Critical role for caspases3 and8 in neutrophil but not eosino