1、實驗四、土壤中放線菌的分離一、實驗?zāi)康?、從土壤中分離、純化放線菌；初步掌握藥用微生物的分離純化方法和操作技術(shù)。2、了解不同生境條件中土壤放線菌的種類與數(shù)量。二、實驗內(nèi)容篩選放線菌永遠是新抗生素研究的課題之一。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的抗生素約有80%來自于放線菌。土壤中放線菌最豐富，品種齊全。通常情況下，放線菌在比較干燥、偏堿性、含有機質(zhì)豐富的土壤中數(shù)量居多。隨著地理分布、植被及土壤性質(zhì)的不同，放線菌的種類、數(shù)量和拮抗性也各不相同。從堆肥或過熱的材料中如干草或蔗渣中可分離到大量的嗜熱放線菌，從淡水和海洋環(huán)境中可分離到嗜堿性的和嗜酸性的菌種。土壤中含有的放線菌主要是鏈霉菌，人們通常將除鏈霉菌以外的其它

2、放線菌統(tǒng)稱為稀有放線菌，如小單孢菌、游動放線菌、諾卡氏菌等，它們是生物活性物質(zhì)重要的產(chǎn)生菌。但往往由于樣品中稀有放線菌的數(shù)量太少，常規(guī)的分離方法很難得到。對樣品進行風(fēng)干、干熱處理、培養(yǎng)基添加重鉻酸鉀等方法可以減少細菌和真菌的數(shù)量，以提高放線菌的獲得率。用干熱和苯酚處理可減少鏈霉菌數(shù)量和比例的方法，可以分離得到更多種類的放線菌。土壤中分離放線菌的方法很多，其中包括稀釋法、彈土法、混土法和噴土法等，本實驗主要采用稀釋法來獲得放線菌。注：從土壤中分出的放線菌要進一步鑒別是否為抗生菌。首先應(yīng)根據(jù)篩選目的確定試驗?zāi)Ｐ停缓罄门囵B(yǎng)基平板進行拮抗性測定。常用的方法有瓊脂塊法和濾紙片法。其主要依據(jù)是擴散原理

3、，即觀察在抗生菌周圍是否會出現(xiàn)明顯的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度則表明了該菌株抗菌活性的強弱。三、實驗原理、方法和手段原理一：稀釋涂布平板法；如圖1。原理二：對樣品進行風(fēng)干、干熱處理以減少細菌和真菌的數(shù)量；原理三：向培養(yǎng)基添加適量的重鉻酸鉀能抑制其他細菌、真菌的生長，但不影響放線菌的生長。圖1 稀釋涂平板法示意圖四、實驗組織運行要求根據(jù)本實驗的特點、要求和具體條件，采用“采用集中授課形式，分組試驗進行”的組織運行模式。五、實驗條件試劑與儀器試劑：可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4·3H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉

4、、pH 試紙、重鉻酸鉀儀器：微波爐、電磁爐、干燥箱、50 或100mL 量筒（滅菌）、玻璃涂鏟（滅菌）、90mm 培養(yǎng)皿（滅菌）、250ml三角瓶（滅菌）、1 或 2mL 移液管（滅菌）、試管（滅菌）、小玻璃珠（滅菌）、標(biāo)簽紙、洗耳球。培養(yǎng)基：高氏1號合成培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH:7.2-7.4，瓊脂20 g，水1000 mL，分裝，高壓濕熱滅菌。培養(yǎng)基制備過程：稱取一定量可溶性淀粉，放入裝有少量水的小燒杯中

5、，用玻棒將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。再稱取其他各成分依次溶解。對微量成分FeSO4·7H2O 可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在10ml 水中加入0.1g 的FeSO4·7H2O 配成0.01g/ml 母液，再在1000ml培養(yǎng)基中加入1ml的0.01g/ml 的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積，調(diào)節(jié)pH、分裝、包扎、濕熱滅菌。土樣：從校園各處采樣。要求學(xué)生到不同生境、不同深度土壤中取樣，如：塘泥、森林、苗圃、路邊菜園土或林地土，適量、自然風(fēng)干，待用。六、實驗步驟土樣基本處理：每處理隨機取不同土

6、壤約100 g，自然條件下風(fēng)干，顏色由深變淺后碾碎，過孔徑為840 m（20 目）的土壤篩（或人工挑取較大的石粒或土塊）。用無菌的報紙將土樣包好（單層），放到電熱鼓風(fēng)干燥箱中，60干熱處理1h。（教師在課堂講授前先指導(dǎo)學(xué)生完成該步驟的實驗）倒平板：將裝有滅好菌的高氏一號培養(yǎng)基的三角瓶直接置于微波爐中加熱溶解（視情況定加熱時間，注意掌握好加熱的時間）、冷卻后倒平板，每皿約20 mL。待充分冷卻后用于涂布。稱取待測樣品10.0 g（盛放于滅菌紙中），放入裝有90 mL 無菌水的250 mL 三角瓶中，充分振蕩10 min，即配成10-1 稀釋度的土懸液；用移液管量取1mL 稀釋度為10-1 的土壤

7、懸浮液于裝有9mL 無菌水的試管中，充分振蕩，即配成10-2 稀釋度的土壤懸浮液，按此法依次配成10-3，10-4 稀釋度的懸浮液。用平板表面成菌落法測定土壤中微生物數(shù)量。將配好不同稀釋度（10-2，10-3，10-4）的菌懸液，用無菌移液管吸取0.2 mL 土壤懸液接種在不同的稀釋度編號的平板上，每個處理重復(fù)2 次，用無菌刮鏟將菌液在平板上均勻涂開，每個稀釋度用一個刮鏟，如果從低濃度到高濃度涂布，可不用換刮鏟。將涂好的平板置于操作臺面上2030 min，使菌液充分滲透于培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒放，置于28 條件下恒溫培養(yǎng)至長出菌落開始計數(shù)，觀察。每組在每個濃度兩個平板分兩種處理：一組無需向高氏

8、一號培養(yǎng)基中加入0.5 重鉻酸鉀溶液，直接置于微波爐中加熱溶解、冷卻后倒平板；另一組需向已加熱溶解并冷卻至60高氏一號培養(yǎng)基中加入1.5 mL 0.5%重鉻酸鉀溶液，充分搖勻后倒平板。七、作業(yè)實驗記錄一、土樣處理步驟 （將之前得到的土樣60干熱處理1h拿到稱取待測樣品10.0 g） （將土樣溶解溶于250 mL 三角瓶中無菌水中，變渾濁，即得10-1 稀釋度的土懸液）(將10-1稀釋度的土懸液稀釋成 10-2 、10-3 、10-4稀釋度的土懸液，顏色隨濃度降低變淺 )二 倒平板步驟倒平板前的實驗處理將裝有滅好菌的高氏一號培養(yǎng)基的三角瓶直接置于微波爐中加熱溶解（微波爐中加熱溶解）冷卻后倒平板，

9、每皿約20 mL。（準(zhǔn)備十二個平板用于分兩組處理情況，一組六個 每一個濃度四個處理。一組為無重鉻酸鉀處理 一組為添加了重鉻酸鉀1.5 mL 0.5%）倒平板步驟將配好不同稀釋度（10-2，10-3，10-4）的菌懸液，用無菌移液管吸取0.2 mL 土壤懸液接種在不同的稀釋度編號的平板上，每個處理重復(fù)2 次用無菌刮鏟將菌液在平板上均勻涂開，每個稀釋度用一個刮鏟（涂布，將不同稀釋度的懸浮液涂布到平板上）將涂好的平板置于操作臺面上2030 min，使菌液充分滲透于培養(yǎng)基內(nèi)然后將平板倒放，置于28 條件下恒溫培養(yǎng)3天至長出菌落開始計數(shù)，觀察三土壤中（濕重）放線菌的數(shù)量及培養(yǎng)的特征描述（有重鉻酸鉀10-

10、2 稀釋度）（無重鉻酸鉀 10-2 ）（有重鉻酸鉀10-3 稀釋度）（無重鉻酸鉀10-3 稀釋度）（無重鉻酸鉀10-4 稀釋度）（有重鉻酸鉀10-4 稀釋度）分析與描述1數(shù)量土壤濃度越高的培養(yǎng)基中放線菌的數(shù)量越多，其中中等濃度的放線菌長勢最好，而且數(shù)量大約是隨著濃度梯度呈現(xiàn)成倍增加。2外觀與干燥度放線菌的菌落質(zhì)地緊密，表面呈緊密的絨狀，或者堅實，干燥且不易挑起，或者被挑起后不容易破碎。當(dāng)孢子絲形成大量孢子布滿菌落表面時，使菌落呈現(xiàn)絮狀或者顆粒狀。3無重鉻酸鉀的培養(yǎng)基 中除放線菌以外還有其他類型細菌的菌落，呈現(xiàn)絮狀 外觀為淺黃色的八、注意事項添加重鉻酸鉀要適量；注意涂平板的方法；3 天和5 天后

11、請記錄觀察實驗結(jié)果。九、結(jié)果記錄與分析取平均數(shù)菌液稀釋度放線菌個數(shù)/（有重鉻酸鉀）放線菌個數(shù)/（無重鉻酸鉀）10-260035010-328018010-41020分析1高氏培養(yǎng)基的配制關(guān)鍵是PH值得調(diào)節(jié)和重鉻酸鉀的加入，放線菌最適生長的溫度是在2327都 PH是7.07.5.而在同樣的條件下也有利于霉菌的生長。在高溫條件下，放線菌和霉菌都不能被完全殺死，仍可以存活，加入重鉻酸鉀可以抑制霉菌和細菌的生長，而對放線菌不抑制。分析2整個環(huán)境要在無菌的條件下進行 ，培養(yǎng)基以及實驗過程使用的刮鏟，報紙等等要經(jīng)過滅菌處理。接種是在火焰區(qū)的無菌范圍內(nèi)操作，且打開培養(yǎng)基的時間要控制好，補課過長。分析3稀釋倒平板法涂布是要均勻，否則，細菌密度不