1、.Western Blot 配液：1. 10% SDS溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH2O 1ml加熱溶解，室溫保存，用后馬上擰緊瓶蓋。2. 10% 過硫酸銨:APS 0.1gDDH2O 1ml由于過硫胺酸會緩慢分解，最好新鮮配制，或隔周配制（也可每200微升EP分裝，4保存4W，-20保存1月）3. 1× 電泳緩沖液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸餾水溶解至1000ml，調整PH 8.3。冰箱內可保存數月。4. 10 × 轉膜液（儲存液）甘氨酸 72.07gTris base 15.14gDDH2O 400ml加水至50

2、0ml， 儲存液不加甲醇，4保存。1 × 轉膜液 1L配制：10 × 轉膜液儲存液100ml，150ml甲醇，加DDH2O 750ml，PH 8.5，定容至總量1L5. 1 × 轉膜液（現配現用）：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇 150ml加水定容至1000ml6. 10 × TBS： Tris base 12.1g NaCl 40g加水，用濃鹽酸調整PH至7.6后定容至500ml7. TBST： 1 × TBS/吐溫 = 1000/18. 封閉液： 脫脂奶粉 2g TBST 40ml配膠：先配分離膠，再配積層膠

3、。一般兩者同時配制，只是最后分離膠先加TEMED混合后立即灌膠，而積層膠放4，等分離膠凝固后再加TEMED混勻后灌膠。（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據實驗當時的溫度適當調整） 2ml 5%積層膠3ml 5%積層膠5ml 8% 分離膠5ml10% 分離膠10% 兩塊膠5ml15%分離膠超純水 1.42.12.31.92.851.130Acr/Bic0.330.4951.31.72.552.51.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）1.31.30.951.31 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 0.250.375

4、10SDS 0.020.030.050.050.0750.0510%APS（過硫胺酸） 0.020.030.050.050.0750.05TEMED 0.0020.0030.0030.0020.0030.002雙丙烯酰胺：丙烯酰胺摩爾比1：29配制時，SDS-PAGE有效分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用于60200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10%用于 1670kDa，15%用于1245kDa。步驟：（1） 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，用

5、洗潔精將板洗凈。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2） 配膠與上樣：先配分離膠，再配積層膠。1、 玻璃板對齊后放入制膠架中卡緊（一定要對齊，以免漏膠）。然后垂直卡在夾子上準備配膠。2、 按前面方法配10分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，用槍吸取1ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶下緣以下5mm高度時即可，給積層膠留出足夠空間（梳齒長再加1cm）。然后膠上加一層去離子水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢，否則膠會被沖變型。）3、 當水和膠之間有一條折射

6、線時，說明膠已凝固（30min）。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上的水，再用去離子水洗滌數次，并用濾紙將水吸干。4、 按前面的方法配5的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平（梳子使用前保證干凈且干燥）。待到濃縮膠凝固后（室溫30min），將凝膠放入電泳槽中，小玻璃板面朝內（若只跑一塊膠，則槽的另一邊要墊一塊塑料板，且有字的一面朝內）。在上下槽內加入電泳液，上槽內的電泳液應沒過小玻璃板上緣，下槽內的電泳液應沒過金屬絲，排除凝膠底部兩塊玻璃板之間的氣泡。加入電泳液后，兩手分別

7、捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5、 用電泳液沖洗一下濃縮膠，（目的是去除梳子遺留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成條帶變形） 可以前一天配膠備用，保鮮膜4度保存，可一周。6、制備樣品：測完蛋白濃度后，計算含2050g蛋白（根據自己的實驗需要進行選擇，沒有固定的量，一般為4050ug。）的樣品體積即為上樣量。取出上樣樣品至200l的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×（上樣緩沖液與樣品蛋白體積之比為1:4）。（上樣體積一般在10l與20l之間）（其實大一點的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達到40l，膠做得很好的話，50l問題也不大）上樣前要將樣品100加熱5-15

8、min使蛋白變性，立即冰浴，然后低速離心5min。（可以使用PCR儀進行變性（95,10min）應根據上樣緩沖液濃度的不同，制備樣品。樣品分裝成小管，儲于-80。蛋白質在非變性條件下的電泳分離是由其分子量大小與電荷共同決定的，在變性條件下與SDS結合后，其電泳分離只由分子量大小決定。7、 加足夠的電泳液后準備上樣。上樣之前一定要把上樣孔沖洗干凈，沖走未凝固的丙烯酰胺。用移液槍將樣品吸出，注意不要吸進氣泡。將槍頭插至上樣孔中加入樣品（上樣速度要快，防止樣品擴散導致相互影響，但上樣過快又會使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時要換槍頭，以免交叉污染）。一般marker（Fer

9、mentas的0671或0441）加6ul。為避免邊緣效應，最好選擇中間的孔上樣。8、 電泳：將電泳槽與電泳儀相接，紅接紅，黑接黑。跑濃縮膠時用80V，到分離膠后用120V。溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜（一般讓目的條帶跑過分離膠的1/3比較好。當然，不要局限于此說明）。電泳時間也取決于要檢測的蛋白分子量的大小。9、 轉膜（1）從負極（黑板）到正極（透明板）方向依次：纖維墊、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、纖維墊，呈三明治樣。在加有轉膜液的盤里放入轉膜用的夾子、兩塊纖維墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。（2） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張纖維墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。（

10、一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起再墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（3） 將小玻璃板撬掉，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬（撬時一定要小心，膠很易裂，要用巧勁）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠，根據需要橫向切膠，并根據膠的大小裁剪同樣大小PVDF膜，剪去膜的右上角作為標記（當剪去的角在右上方時有蛋白面朝上，在右下方時有蛋白面朝下）。如果樣本多，同時做幾張膜，可用鉛筆在膜下角標ABCD或1234，這樣可以分出膜的正反和加樣順序。注意：裁濾紙和膜時一定要戴手套，因為

11、手上的蛋白會污染膜。將裁好的PVDF膜置于甲醇中浸一下才可使用。在膜上蓋3層濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個纖維墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉膜液中進行，要不斷的搟去氣泡。（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）（最后做成的“三明治”千萬不能形成短路，不然有可能會短路燒壞轉膜裝置）。（4） 將夾子放入轉膜槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。轉膜時會產熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。液面應該沒過夾子上緣，在電泳槽周圍放置碎冰，打開電源，280mA ，1.5h。（1.應根據蛋白分子量的大小確定轉膜時間，對于小分子量的蛋白，轉膜時最好墊兩塊PVDF膜，以免轉膜過頭，

12、因為如果第一張膜上蛋白質已經轉過了，第二張膜上還有蛋白質可以進行檢測；對于分子量大的蛋白，轉膜時間要長一點，開始最好也用兩塊膜，特別是務必注意加強降溫措施。當然轉膜是要摸條件的，最好剛開始做的時候摸個轉膜的時間梯度。如果由于時間原因來不及做下面實驗，可以在4度下12V轉膜過夜）（2.PVDF膜建議使用0.22的小孔徑膜，不容易轉膜過頭）（3.不同的轉膜裝置，轉移效率是不一樣的，所以換用轉膜裝置，最好再摸個條件）（4.轉膜時電極方向注意是膜正膠負）10、 考馬斯亮藍染膠（一般不需要做這步）轉完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋

13、白。 將膜晾干備用。11、封閉：洗膜：TBST洗膜一次。封閉：5%脫脂奶粉配制：TBST 40ml +脫脂奶粉2g。將NC膜（蛋白面朝下）移入盛有封閉液的平皿中，室溫搖床孵育1h。12、洗膜：TBST洗膜一次。13、抗體孵育：孵育一抗：用5%脫脂奶粉-TBST按適當比例(一般是1000:1)稀釋一抗（1ml 5%脫脂奶粉：1mlTBST加0.05g奶粉）。裁下一塊封口膜，折成小船鋪于濕盒中，將脫脂奶粉加到小船中，用移液槍把一抗注進奶粉溶液里，搖床上搖一會。膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡。搖床搖半小時后，放在濕盒中4過夜。洗膜：TBST，室溫下搖床上35次×5-10min。孵育二抗：用5%脫脂奶粉-TBST按適當比例（一般小鼠5000:1，兔2000:1）稀釋二抗。將脫脂奶粉加到小船中，把二抗注進奶粉溶液里，搖床上搖一會兒。膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫搖床孵育1h2h。洗膜：TBST，搖床上洗35次×5-10min。14、曝光：（曝光的整個過程需