1、real-timePCR 技術的原理及應用摘要：一、實時熒光定量 PCRM 理（一）定義：在 PCR5 應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個 PCF0 程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。（二）實時原理 1、常規 PCRK 術： 對 PCFT 增反應的終點產物進行定量和定性分析無法對起始模板準一、實時熒光定量 PC 麗理（一）定義：在 PC 皈應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個 PCF0 程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。（二）實時原理1、常規 PCRK 術：對 PCFT 增反應的終點產物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法

2、對擴增反應實時檢測。2、實時定量 PC 敬術：利用熒光信號的變化實時檢測 PCFT 增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過 Ct 值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析3、如何對起始模板定量?通過 Ct 值和標準曲線對起始模板進行定量分析4、幾個概念：(1)擴增曲線：每個循環進行一次熒光信號的收集(2)熒光閾值:熒光信號閾值熒光信號閾值(threshold)工工 前15個循環信號作為熒光本底信號baseline.既樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺省設置是315個循環的毅光信號的驚準儲差的10倍 手動設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的黃光最高值,同時要盡量選擇進入指

3、數期的最初階段， 并且保證回歸系數大于099 真正的信號:熒光信號超過域值(3)Ct 值:黃幫程測元件統壁標擴增循環數(Cycte，級坐標:熒光atftUUBftUUB。鑿JWLLJWLLCt值的定義：PCR擴增過程中， 擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數Ct值的特點工值的特點工相同模板進行9敬擴增，終點處產物量不恒定3織軸：黃光信號量C(f)valueCT 值的重現性:寸與Replicties橫軸 mPCR反映循環數CycIeHumber-Ct值則極具重現性5、定量原理：理想的 PC 皈應：X=X0*2n非理想的 PCR5 應：X=Xo(1+Ex)n:擴增反應的循環次數X

4、:第 n 次循環后的產物量X0：初始模板量Ex:擴增效率5、標準曲線模板模板DNA量越多量越多, ,熒光達到域值的循環數越少熒光達到域值的循環數越少, ,即即Ct值越小值越小Log濃度與循環數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作濃度與循環數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品出標準曲線，根據樣品Ct值值, ,就可以計算出樣品中所含的模板量就可以計算出樣品中所含的模板量6、絕對定量1)確定未知樣品的 C(t)值2)通過標準曲線由未知樣品的 C(t)值推算出其初始量7、DNA 勺熒光標記:非特異性熒光標記：1、SYBRGreen特異性熒光標記:、工四Man，3、Mo

5、lecularBeacon二、實時熒光定量 PCR 勺幾種方法介紹方法一：SYBRGreen 法（一）工作原理1、SYBRGreen 能結合到雙鏈 DNA 勺小溝部位Tm值，DNA解鏈一半時的溫度SGSGSGSGEmssionilliiiiiFIiIIiiiiHinIrF11i111H11mir13O.JH.Ullin,mimin11in1J.UIUJ.1.111UU.Miu_引SGSGSG2、SYBRGreen 只有和雙鏈 DNA 吉合后才發熒光3、變性時，DN 敏鏈分開，無熒光4、復性和延伸時，形成雙鏈 DNASYBRGreen 發熒光，在此階段采集熒光信號NoEmissionExcita

6、tio將溫度與熒光強度的變化求導。（-dl/dT）模板模板DNA量越多，熒光達到量越多，熒光達到攵越少攵越少9qErw9qErw804)804)Log濃度與循環數呈線性關系，根據樣品濃度與循環數呈線性關系，根據樣品Ct值值. .就可以計算就可以計算PC 皈應體系的建立及優化1、SYBRGreen 使用濃度：太高抑制 Taq 酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測2、Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準3、MgCl2 勺濃度：可以降低到 1.5mM,以減少非特異性產物4、反應 Buffer 體系的優化5、反應溫度和時間參數：由酶和引物決定6、其他與常規 PCN 目同（二）應用范圍

7、1、起始模板的測定；2、基因型的分析；3、融解曲線分析：可以優化 PCR5 應的條件，對常規 PCRt 指導意義，如對 primer 的評價；可以區分單一引物、引物二聚體、變異產物、多種產物。（三）優點及缺點優點：對 DNAJI 板沒有選擇性；適用于任何 DNA 使用方便；不必設計復雜探針；非常靈敏；便宜。缺點：容易與非特異性雙鏈 DNA 吉合，產生假陽性；但可以通過融解曲線的分析，優化反應條件；對引物特異性要求較高。方法二：TaqMan-水解型雜交探針與目標序列互補*5端標記有報告基團(Reporter,R)*3端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)*探針完整，R 所發射的熒光能量被

8、Q 基團吸收，無熒光，R與 Q 分開，發熒光*Taq 酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針(一)工作原理注意：每擴增一條 DN 粉子，釋放一個熒光信號，可以在循環過程中任一點檢測熒光PC 皈應的建立：1、引物、探針的設計:ProbeReporterQuencher,如 FAMVIC 等探針 Tm 為 68-70C,30bp,5不能有 G,G 可能會淬滅熒光引物盡量靠近探針，擴增片段400bp,引物 Tm為59-60C2、反應參數的確定：一般為：94C,10-20S60C,30-60S（Taq 酶 53外切核酸酶活性在 60C 最高）也可通過溫度梯度優化退火溫度 72C,45S,3、優化引物和探

9、針濃度：獲得最小 Ct 值，信號/背景比值的最大引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規 PCRlf 同（二）優缺點優點：對目標序列的高特異性-陰性結果確定設計相對簡單-與目標序列某一區域互補重復性比較好缺點：只適合一個特定的目標；委托公司標記，價格較高；不易找到本底低的探針Real-timePCR 與 RT-PCRt 匕較2009-08-2016:50:02 來源：未知【大中小】評論：條摘要：Real-timePCR 與 RT-PC 幅兩種不同的 PC 昉法，適用范圍也不同。Real-timePCR 中文譯作實時聚合酶鏈反應， 是一種最新發展的定量 PCRK術。該技

10、術借助于熒光信號來檢測 PCFT 物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到 PC 陶循環一次就收集一個數據，建立實時擴Real-timePCRt 段的合適瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（）線性 DNAt 段的有效分離范圍（kb）0.51-300.70.8121.10.5101.20.4-70.2-3六、需注意的問題：1、注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、澳化乙錠（EB）、酚、異硫富酸服、紫外線等2、注意避免試劑污染3、始終注意避免 RNA1 的污染：4、保管好自己專用的試劑，公用試劑保管好，相互協調，注意實驗室衛生RealtimePCR 跟 RT-PCRt 什么區別關鍵詞：reajtimeP

11、CRRT-PCR 區別 I?2008-07-2300:00 來源:丁香園點擊次數：4932實時熒光定量 PCRM 理所謂實時熒光定量 PC 做術，是指在 PC 皈應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個 PCFffi 程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。.內標在傳統定量中的作用由于傳統定量方法都是終點檢測， 即 PCRIU 達平臺期后進行檢測， 而 PCRg過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在 96 孔 PCFa上做 96 次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。.實時熒光定量 PCRB 需內標實時熒光定量 PCRK 術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品 Ct 值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量 PCRB 需內標是建立在兩個基礎之上的：Ct 值的重現性PCR