1、2021/4/21第十六章腫瘤的誘導分化和第十六章腫瘤的誘導分化和凋亡療法凋亡療法2021/4/222021/4/23人體細胞總數：人體細胞總數：1014 類型：類型：200多種多種2021/4/24細胞可以通過增殖來增加數目，細胞可以通過增殖來增加數目，那么細胞通過什么方法來改變那么細胞通過什么方法來改變其結構和功能呢？其結構和功能呢？2021/4/25 由同源細胞逐漸變由同源細胞逐漸變為在形態結構、生為在形態結構、生理功能和生化特征理功能和生化特征等方面具有穩定差等方面具有穩定差異的另一類型細胞異的另一類型細胞的過程。的過程。2021/4/26干細胞 干細胞(stem cells, SC)

2、是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。 干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界稱為“萬用細胞 2021/4/27分化異常與分化異常與腫瘤干細胞腫瘤干細胞 傳統觀念認為,腫瘤是由體細胞突變而成,每個腫瘤細胞都可以無限制地生長。但這無法解釋腫瘤細胞似乎具有無限的生命力以及并非所有腫瘤細胞都能無限制生長的現象 腫瘤干細胞：腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞。2021/4/28Self renewal and differentiation are random.All c

3、ells have equal but low probability ofextensive proliferation. Only cells with selfrenewal capacity can sustain tumor growth.Distinct classes of cells exist within atumor. Only a small definable subset, the cancer stem cells can initiate tumorgrowth.2021/4/29Two General Models for Cancer Heterogenei

4、ty異質性1. All cancer cells are potential cancer stem cells but have a low probability of proliferation in clonogenic assays （隨機模式）2. Only a small definable subset of cancer cells are cancer stem cells that have the ability to proliferate indefinitely.（干細胞模式）2021/4/210Origin of the Theory of Cancer Ste

5、m CellsOnly a small subset of cancer cells is capable of extensive proliferation Liquid TumorsIn vitro colony forming assays:- 1 in 10,000 to 1 in 100 mouse myeloma cells obtained from ascites away from normal hematopoietic cells were able to form coloniesIn vivo transplantation assays:- Only 1-4% o

6、f transplanted leukaemic cells could form spleen coloniesSolid Tumors- A large number of cells are required to grow tumors in xenograft models- 1 in 1,000 to 1 in 5,000 lung cancer, neuroblastoma cells, ovarian cancer cells, or breast cancer cells can form colonies in soft agar or in vivo 2021/4/211

7、Therapeutic implications of Cancer Stem Cells Most therapies fail to consider the difference in drug sensitivities of cancer stem cells compared to their non-tumorigenic progeny. Most therapies target rapidly proliferating non-tumorigenic cells and spare the relatively quiescent cancer stem cells.20

8、21/4/212第一節第一節 誘導分化與腫瘤治療誘導分化與腫瘤治療 腫瘤細胞在一定條件和誘導分化劑的作用腫瘤細胞在一定條件和誘導分化劑的作用下可以向正常細胞轉化下可以向正常細胞轉化2021/4/213Wnt, Shh, and Notch pathways have been shown to contribute to the self-renewal of stem cells and/or progenitors in a variety of organs, including the haematopoietic and nervous systems. When dysregula

9、ted, these pathways can contribute to oncogenesis. Mutations of these pathways have been associated with a number of human tumours, including colon carcinoma and epidermal tumours (Wnt), medulloblastoma and basal cell carcinoma (Shh), and T-cell leukaemias (Notch). Pathways involved in self-renewal

10、that are deregulated in cancer cells2021/4/214誘導分化劑誘導分化劑 1. 極性化合物: 包括二甲亞砜(DMSO) 2. 佛波酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13 acetate，TPA)。3. 維生素D3及其衍生物4. cAMP及其衍生物5. 細胞因子: 包括G-CSF、GM-CSF、IFN、 TGF-、TNF、6. 芳香族脂肪酸: 包括桂皮酸、苯丁酸、苯乙酸及其衍生物等。7. 抗腫瘤藥物: 包括MTX、DDP、Ara-c、三尖杉酯堿、抗腫瘤抗生素、地塞米松等。8. 中藥提取物及復合制劑: 包括姜黃素、人參總皂甙。9. 維

11、A類化合物:10. 其它類: 包括5-氮雜-2-脫氧胞核苷(ADC)、蛋白磷酸化劑(銀毛酸)、星形孢菌素、乳香酸、三氧化二砷等。2021/4/215全反式維甲酸All-trans-retinoic acid 全反式維甲酸(ATRA)，也叫做維A酸。其抗腫瘤作用的證實被譽為九十年代國際抗癌藥物的三大發現之一，具有很強的誘導分化腫瘤細胞作用，備受國際國內醫藥界的關注，是目前國內治療急性早幼粒細胞白血病、骨髓異常增生（白血病前期）尤其是早幼粒細胞白血病的臨床首選藥物。2021/4/216ATRA聯合三氧化二砷治療APL 位于15號染色體上的早幼粒白血病基因與17號染色體上的維甲酸受體基因易位，形成特

12、定的融合基因，導致急性早幼粒細胞白血病This schematic presentation of the translocation (15;17)(q22;q12), characteristic of APL (M3), involves the genes PML-RAR-alpha 2021/4/217 維甲酸和砷劑通過不同的途徑，靶向作用于該型白血病的同一關鍵致病基因編碼的蛋白質。因此提出兩藥共用的協同靶向治療設想2021/4/218思考題 細胞分化、腫瘤細胞分化特點細胞分化、腫瘤細胞分化特點 干細胞、腫瘤干細胞干細胞、腫瘤干細胞 誘導分化劑誘導分化劑2021/4/219第三節第三

13、節 誘導凋亡與腫瘤治療誘導凋亡與腫瘤治療 1972年Kerr Apoptosis(凋亡) 編程性細胞死亡(programmed cell death，PCD) 細胞凋亡是形態學概念，編程性細胞死亡大多表現為細胞凋亡，但并非所有編程死亡的細胞都有細胞凋亡的形態特征 2021/4/220Normal white blood cell Apoptotic white blood cellDuring apoptosis (programmed cell death) cells bleb and eventually break apart without releasing contents.20

14、21/4/221Apoptosis during the metamorphosis of a tadpole into a frog.The cells in the tadpole tail are induced to undergo apoptosis stimulated by the increases in thyroid hormone that occurs during metamorphosisC. elegans是研究PCD的理想材料（生命周期短，細胞數量少）。1030 cells generated but 131 cells die2021/4/222Types o

15、f cells that undergo apoptosisApoptosis in the embryonic mouse paw.Apoptosis occurs between 12.5 to 14.5 days in embryogenesisApoptosis and normal morphogenesis.TUNEL assay (immunodetection) detects breaks in DNA as cells undergo apoptosis+ 1 day2021/4/223Apoptosis is also important in the developme

16、nt of the nervous system2021/4/2242021/4/2252002年10月7日英國人Sydney 、美國人Horvitz和英國人Sulston ，因在PCD方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫學獎。H. Robert HorvitzJohn E. Sulston Sydney Brenner2021/4/226 細胞凋亡與細胞壞死的區別細胞凋亡與細胞壞死的區別特征特征 細胞凋亡細胞凋亡 細胞壞死細胞壞死誘導因素誘導因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 強烈刺激強烈刺激膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早期即喪失早期即喪失細胞體積細胞體積 減少、固縮減少、固縮 增大腫脹

17、增大腫脹染色質染色質 凝聚成半月形凝聚成半月形 稀疏成網狀稀疏成網狀細胞器細胞器 無明顯變化無明顯變化 腫張破壞腫張破壞溶酶體溶酶體 保持完整保持完整 破壞外溢破壞外溢細胞形狀細胞形狀 形成凋亡小體形成凋亡小體 破裂成碎片破裂成碎片基因組基因組DNA DNA 有控降解有控降解 隨機降解隨機降解大分子合成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要基因調控基因調控 有有 無無受累范圍受累范圍 單個細胞丟失單個細胞丟失 成群細胞死亡成群細胞死亡后果后果 不引起炎癥反應不引起炎癥反應 引起炎癥反應引起炎癥反應意義意義 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方式病理死亡方式誘因形態分子水平轉歸2021/4/

18、227www.roche-applied- 405 |4 MAY 2000 |2021/4/229STAGES OF APOPTOSISSherman et al., 19972021/4/230一一. 凋亡相關基因及端粒酶凋亡相關基因及端粒酶 bcl-2家族 p53基因 C-myc基因 Fas/Fas-L系統 Caspase(半胱天冬蛋白酶)家族 端粒和端粒酶 2021/4/231Apoptosis: PathwaysDeath LigandsEffector Caspase 3Death ReceptorsInitiator Caspase 8PCDDNA damage & p53Mito

19、chondria/Cytochrome CInitiator Caspase 9“Extrinsic Pathway”“Intrinsic Pathway”2021/4/2322021/4/233Bcl-2 FAMILY- Bcl-2- Bcl-XL- Mcl-1-* - Bax- Bcl-XS- Bak- Bad-*Anti-apoptoticPro-apoptotic2021/4/234 細胞內Bax高表達時，細胞對死亡信號敏感，加速細胞凋亡，當Bcl-2高表達，Bcl-2可與Bax形成異源性二聚體，抑制細胞凋亡。所以Bcl-2Bax的比例對決定細胞凋亡的敏感性起重要作用，抑制凋亡因子/促

20、進凋亡因子的總比率，最終決定細胞的的生存或死亡。 2021/4/235Bcl-2在腫瘤中的表達與腫瘤的發生在腫瘤中的表達與腫瘤的發生 Bcl-2在多種腫瘤中的表達已得到證實。 一般來說，Bcl-2陽性的腫瘤要比Bcl-2陰性的腫瘤預后差。 在一些比較常見的惡性腫瘤中，Bcl-2表達經常陽性的有：慢性淋巴細胞白血病、慢性髓白血病伴有原始細胞危象者和急性髓白血病幾乎l00陽性，濾泡淋巴瘤80陽性，T、B非霍奇金淋巴瘤65陽性，霍奇金淋巴瘤40陽性，乳腺癌80陽性，神經母細胞瘤40陽性，鼻咽癌80陽性，前列腺癌75陽性，肺鱗癌25陽性，肺腺癌10-15陽性2021/4/236P53 野生型p53基因

21、為腫瘤抑制基因，編碼p53蛋白， 該蛋白在G1期參與檢查點的作用，負責檢查染色體DNA是否有損傷。 發現DNA損傷，即阻止細胞進入細胞周期，并啟動DNA修復機制，如果修復失敗，p53蛋白啟動細胞凋亡機制 2021/4/2372021/4/238Fas/Fas-L fas又稱作APO-1，屬TNF受體家族。 1993年人白細胞分型國際會議統一命名為CD95。 fas基因編碼產物為分子量45KD的跨膜蛋白。 Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統，二者的結合激活caspase。2021/4/239Ligand-induced cell death“The death receptors”Ligand

22、-induced trimerizationDeath DomainsDeath EffectorsInduced proximity of Caspase 8Activation of Caspase 8FasLTrailTNF2021/4/240C-myc 具轉錄因子活性，與DNA結合調節其他基因的轉錄活性。其編碼一個壽命很短的DNA結合蛋白，幾乎在所有的腫瘤細胞中表達異常。IHC image of c-Myc staining in human breast carcinoma C-myc-DNA complex2021/4/241C-myc在腫瘤中的活化2021/4/2422021/4

23、/243 C-myc蛋白具有雙重功能，既可以激活介導細胞增殖，也可以激活介導細胞凋亡，這取決于細胞接受某種信號以及所處的生長環境。 C-myc低水平時，細胞生長停滯； C-myc表達，且有血清生長因子存在時，細胞進入增生狀態； C-myc表達，但取消生長因子(血清饑餓)時，細胞發生凋亡， C-myc可與bcl-2協同轉化細胞，bcl-2抑制C-myc所致的細胞凋亡，但不影響C-myc促有絲分裂的增殖作用。Fas和C-myc陽性表達與瘤細胞高分化趨向一致，C-myc可協助Fas促進細胞凋亡 2021/4/244 Caspase家族 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containi

24、ng aspartate-specific proteases，caspase，) , 在天冬氨酸殘基之后將底物裂解. Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ，Asp ，proteases )由單一3050kd的無活性前體在Asp-X的肽鍵被切割，生成1720kd和1012kd的大小亞基，酶的活性形式是大小亞基組成的四聚體；Caspase蛋白水解酶有2個特征： 、都是半胱氨酸蛋白酶； 、作用部位都在天冬氨酸殘基后的位點2021/4/245Caspase家族的組成家族的組成 1、Caspase-2，-8，-9，是細胞凋亡的起始Caspase. (initiat

25、or ) 2、Caspase-3，-6，-7，執行細胞凋亡，是效應Caspase. (effector) 這兩組Caspase在細胞凋亡中缺一不可。 3、由Caspase-1，-4，-5組成，與細胞凋亡的關系不是很密切，可能與多種炎癥因子的成熟有關2021/4/246 Caspase classification（Zimmermann 2001）Executioner or effectorAutocatalytic initiator2021/4/247使抑制凋亡因子失活，如使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD CAD: Caspases activated dexyribonucleas

26、e ICAD: Inhibitor of CAD破壞細胞結構，如核纖層破壞細胞結構，如核纖層（Lamina）Caspase 如何殺死細胞？如何殺死細胞？2021/4/248SUBSTRATES for CASPASES . PARP . DNA-PK. pRb. Lamins. NuMA. Fodrin. -Aktin. Mdm2. Cyclin A2. Presenilin. Others2021/4/249 端粒和端粒酶 端粒端粒端粒端粒中心粒中心粒圖圖 真核生物染色體真核生物染色體2021/4/250 末端復制問題末端復制問題端粒酶(telomerase)的激活。 端粒酶是一種核糖-核蛋

27、白復合體，其中RNA和蛋白質是端粒DNA合成所必須的。能以自身的RNA為模板，逆轉錄合成DNA，以補償細胞分裂時染色體末端縮短，解決“末端復制問題”2021/4/251 腫瘤細胞中端粒的動態 第一期：開始縮短，保護功能。 第二期：端粒功能異常，DNA監控機制使細胞停滯，凋亡 第三期：DNA檢測缺陷，端粒DNA繼續丟失，細胞基因組更加不穩定。 第四期：端粒酶活性升高，端粒功能得以重建。大部分腫瘤在發育到第四期前不易檢測到2021/4/252三、凋亡的檢測方法 1、形態學檢測 2、生物化學檢測 3、分子水平檢測2021/4/2531、細胞凋亡的形態學檢測細胞凋亡的形態學檢測 （1 ）光學顯微鏡和倒

28、置顯微鏡）光學顯微鏡和倒置顯微鏡 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。 （2 ）熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡）熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡 一般以細胞核染色質的形態學改變來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。 （3 ）電子顯微鏡觀察）電子顯微鏡觀察2021/4/254Nuclear morphological changes of HeLa

29、cells in apoptosis process （488nm 400）2021/4/255 電鏡觀察電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡期的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象的空泡結構。細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。2021/4/2562、生物化學檢測 （1）磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） （2）線粒體膜勢能的檢測 JC-1 （3）DNA片斷化檢測 DNA Ladder 測定 DNA含量分析 （4）TUNEL法2021/4/257（1 1）磷脂酰絲氨酸（）磷脂酰絲氨酸（PSPS）外翻分析）外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法

30、） 磷脂酰絲氨酸（磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PSPhosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，在凋亡早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。 Annexin-V能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、R-PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發生。2021/4/258磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 2021/4/259Annexin V-FITC FluorescencePI Flu

31、orescence2021/4/260（2）線粒體膜勢能（）線粒體膜勢能（mt） 線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、JC-1、TMRM等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。2021/4/261Mitochondrial staining with JC-1 The dye undergoes a reversible change in fluorescence emission from green to red as mitochondrial membrane potential increases. Cel

32、ls with high membrane potential promote the formation of dye aggregates, which fluoresce red; cells with low potential will contain monomeric JC-1 and fluoresce green. Therefore, the red/green ratio can help to identify a cells status. the mitochondria stained with JC-1 in a normal cell (left panel) and the mitochondrial potential collapse induced by hydrogen peroxide in NIH-3T3 cells (A: Basal state; B: After Hydrogen Peroxide).2021/4/262（3）DNA片斷化檢測(DNA ladder)：染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜2021/4/263DNA含量分析DNA Damage2N4N2N4NG