1、活血熄風方對局灶性腦缺血大鼠血管內皮生長因子mRNA表達的影響         【摘要】   目的觀察活血熄風方對局灶性腦缺血模型大鼠腦梗塞體積及腦中血管內皮生長因子（VEGF mRNA）表達的影響。方法Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組，模型組，活血熄風方高、中、低3個劑量組（劑量分別為20，10，5 g·kg-1）和尼莫地平對照組（0.02 g·kg-1），采用光化學法建立局灶性腦缺血大鼠模型，造模前7d灌胃給藥，造模后24 h 取材，TTC染色法測腦梗塞體積，逆轉錄聚合酶鏈式反

2、應（RT-PCR）法測VEGF mRNA表達。結果 與模型組比較，活血熄風方各劑量組的腦梗塞體積明顯減少（P0.01），VEGF mRNA表達明顯升高 (P0.01)。結論活血熄風方可明顯減少局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積，具有腦保護作用，其作用機制可能與增強VEGF mRNA表達有關。 【關鍵詞】   活血熄風方；光化學法；血管內皮生長因子mRNA； 逆轉錄聚合酶鏈式反應； 局灶性腦缺血  ChinaAbstract:ObjectiveTo observe the effects of  Huoxue Xifeng Recipe (HXR) on infarctio

3、n volume and the expressions of VEGF mRNA in brain tissue after focal cerebral infarction(FCI) in rats.MethodsWistar male rats were randomly divided into six groups: sham group, model group, HXR treated group(20，10，5 g·kg-1 as high，middle and low dose respectively) and nimodipine control group(

4、0.02 g·kg-1). The model of FCI was established based on the principle of photo-chemistry initiation of thrombosis, intragastric administration continued 7 days before modeling and draw the material after 24h. Infarction volume was detected by TTC staining technique, the expression of VEGF mRNA

5、was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). ResultsThe infarction volume was decreased and the expressions of VEGF mRNA was higher in HXR trerted groups than that of FCI model rats (P0.05 or P0.01).ConclusionHXR can decreased infarction volume and has a protective effect

6、 on FCI rats, and the mechanism may be related to increasing the expression of VEGF mRNA.Key words:Huoxue Xifeng Recipe;  Photo-chemistry;  VEGF mRNA;  RT-PCR;  Focal cerebral infarction腦缺血后，由于腦組織缺血、缺氧，缺血中心區細胞迅速死亡，半暗區神經細胞處于低氧、低灌注狀態，及時恢復該區域血流供應有望改善患者的神經功能。而半暗區血流的恢復有賴于側枝循環的建立，血管再生是

7、決定這些細胞存活的關鍵因素，與缺血性腦卒中病人的預后關系密切1。在血管再生過程中，眾多因子參與調節，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 是已知作用最強和特異性最高的促血管生長因子2，在血管生成和神經保護方面發揮著重要作用。活血熄風方是在“淤血生風”假說3基礎上提出的 治療 中風的新組方，全方以活血化淤為主，通過活血化淤以求逐淤熄風，經驗證療效滿意，已有實驗證實活血熄風方具有腦保護作用4。本實驗用TTC染色法觀察光化學法誘導的局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積大小，采用RT-PCR技術觀察VEGFmRNA的表達以及活血熄風方對上述方面的干預

8、作用，來探討活血熄風方腦保護的作用機制。 1  材料與儀器 1.1  動物健康雄性Wistar大鼠，體質量200250g，山東魯抗醫藥有限公司提供合格證號：SCXK(魯)20050017。1.2  藥物活血熄風方，由當歸、紅花、川芎、水蛭等藥物組成，蒸餾水浸泡1 h，水煎2次，30 min/次，兩次煎液混勻，旋轉蒸發儀分別濃縮至2，1，0.5 g·ml-1，4保存備用。尼莫地平片，山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司生產，每片20 mg，使用前用蒸餾水溶解成含量為2 mg·ml-1的混懸液。1.3  試劑與儀器Trizol  R

9、eagent（美國 Invitrogen）；DNA Marker DL2000、Taq 酶、Ribonuclease inhibitor、dNTP  Mixture（大連寶生物）；M-MLV Reverse Transcriptase（美國 Promega）；玫瑰紅(美國Sigma) ；紅四氮唑(TTC) （化學純，北京化工廠）。梯度PCR系統（ICYCLER型，美國BIO-RAD公司）；DXY-2穩壓穩流電泳儀及電泳槽（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統（Gel Doc 2000型，美國BIO-RAD公司）；低溫高速離心機（Sigma3k30，德國Sigma公司）；紫外分光光度儀（UV

10、-1601 型，日本島津）；立體定位儀（美國Stoelting公司）；IPP像采集分析系統（美國）。2  方法 2.1  分組與給藥大鼠隨機分為6組：假手術組、模型組、活血熄風方高劑量組、活血熄風方中劑量組、活血熄風低劑量組、尼莫地平對照組，每組12只，其中6只用于TTC染色，6只用于RT-PCR。各組均給予手術造模，假手術組股靜脈注射藥物為生理鹽水，其余操作同模型組。各組造模前7 d灌胃給藥，活血熄風方高、中、低劑量組分別給予活血熄風方20，10，5 g·kg-1·d-1，對照組給予尼莫地平0.02 g·kg-1·d-1，假手術組和

11、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。1次/d，末次給藥1 h后造模。2.2  局灶性腦缺血性大鼠模型的制備采用光化學法誘導制備局灶性腦缺血性大鼠模型，根據Waston等5的方法略加改動，具體方法室溫25條件下，雄性Wistar大鼠10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，立體定位儀固定大鼠頭部，常規消毒后，沿頭正中切口分離至暴露完整的顱骨，以矢狀縫右側3 mm，冠狀縫后3 mm為中心用牙科平鉆開直徑約6 mm的骨窗，去除顱骨表層骨板，保留下層骨板及硬腦膜，經股靜脈緩慢注入5%玫瑰紅80 mg·kg-1，時間為1 min，注射結束5 min后用冷光源照射骨窗20 min

12、。2.3  TTC染色測腦梗塞灶體積造模后24 h，大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，預冷生理鹽水沖洗殘血，去掉嗅球、小腦和低位腦干，-20冰凍腦組織20 min，在視交叉處冠狀位切腦，其后間隔2 mm連續做6個冠狀切片，迅速放入2% TTC溶液中，37恒溫孵育20 min，染色后置4%多聚甲醛中固定，正常組織為紅色，缺血區為白色，24 h后用掃描儀將圖像掃描輸入電腦，采用圖像采集處理系統測量梗塞灶面積，各腦片梗塞面積之和乘以厚度為總的梗塞體積。2.4  RT-PCR法測腦組織VEGF mRNA表達大鼠造模后24 h，麻醉后迅速斷頭取腦，取缺血側大腦頂葉皮層，液氮速凍后，-70冰箱保

13、存備用。2.5  學方法SPSS13.0統計軟件進行統計處理，所有數據均用±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，成組數據比較采用t檢驗，以P0.05 為具有統計學意義。         3  結果 3.1  活血熄風方對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積的影響大鼠腦經TTC染色后，除假手術組外均在照射區大腦皮層出現白色梗塞灶，梗塞灶部位恒定，邊界清晰，冠狀面梗塞灶呈“碗形”，尖端指向側腦室，深達皮質全層，表明造模成功。活血熄風方各劑量組及尼莫地平組腦梗塞灶體積均較模型組減小，學差異

14、顯著(P0.01)。活血熄風方各劑量組與尼莫地平對照組比較，無明顯差異（P0.05）。結果見表1，1。表1  活血熄風方對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積的影響（略）3.2  活血熄風方對局灶性腦缺血大鼠腦組織VEGF mRNA 表達的影響與假手術組比較，模型組 VEGF mRNA 表達有所升高（P0.01）。與模型組比較，活血熄風方各劑量組與尼莫地平組均可顯著上調腦組織 VEGF mRNA的表達（P0.01），且活血熄風方各劑量組 VEGF mRNA 表達相對含量均明顯高于尼莫地平對照組（P0.01）。見表2，圖2。表2  對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞邊緣區VEGF mR

15、NA表達的影響（略）4  討論    在缺血性腦血管疾病的研究中人們注意到，VEGF及其受體的促血管形成作用對缺血半暗區血供的改善和側枝循環的建立具有重要意義。VEGF是內皮細胞特異性的有絲分裂原，具有促進內皮細胞增殖，提高血管通透性等生物學特性。腦缺血后，低氧可激活VEGF及其受體系統，促使缺血半暗區VEGF表達，VEGF誘導大量新生血管形成，促進血管增生，增加受累組織的血流灌注和供氧量，減少神經元的凋亡和死亡，減輕腦損傷程度6。   目前發現VEGF主要有Flkl和Flt兩個特異性受體，其中Flkl是發揮生物活性的主要受體7，VEGF與其受

16、體結合后在血管生成和神經保護方面發揮著重要作用8。當腦缺血時，VEGF表達增強，并特異性與Flkl 結合發揮作用。劉氏等9采用原位雜交方法，結果顯示，VEGF mRNA主要在缺血半暗區神經元表達，同時在膠質細胞和血管內皮細胞亦有表達。缺血后48 h半暗區周邊出現血管增生，并逐漸向中心區延伸，于缺血后7d達高峰，整個缺血半暗區可見明顯血管增生。近年來，研究人員開始嘗試利用生長因子能夠促進血管發生及生長的原理， 治療 缺血性血管疾病。目前的治療性血管新生方法中最常用的是外源性促血管生成生長因子的基因治療與重組蛋白質治療，但均存在一定限制和困難10，11。中認為，缺血性中風的病機特點是氣血逆亂，“血

17、菀于上”，即淤血不通，腦脈痹阻，因此常采用活血之法，而活血可祛淤，淤血去則新血生，稱之“祛淤生新”。生新不僅是傳統意義上的生新血，應當還包含有生新絡的含義，淤血去則新血及新絡生，生新又反過來促進淤血的祛除，這與治療性血管新生有相同之處。VEGF 是已知作用最強和特異性最高的促血管生長因子，因此也是體現“祛淤生新”的重要指標。   本實驗TTC染色發現，與假手術組相比，光化學法誘導的局灶性腦缺血模型大鼠大腦皮層出現明顯的梗塞灶（P0.01），同時發現梗塞區周圍腦組織VEGF mRNA 表達有所升高（P0.01）。而與模型組相比，活血熄風方各劑量組能明顯減少梗塞灶體積（P0.0

18、1），同時明顯上調VEGF mRNA的表達（P0.01），且明顯優于尼莫地平對照組（P0.01）。   活血化淤治療腦缺血的一個重要方面是祛淤血生新絡，本實驗采用具有活血作用的活血熄風方，從器官水平上觀察了活血熄風方對局灶性腦缺血大鼠腦梗塞體積的影響，從基因水平上觀察了對腦組織VEGF mRNA表達的影響。本實驗結果顯示，活血熄風方可以明顯縮小模型大鼠的腦梗塞體積，具有明顯的腦保護作用，其作用機制可能與增強局灶性腦缺血大鼠梗塞周圍腦組織VEGF mRNA表達，從而促進缺血半暗帶區的血管新生有關。【 參考 文獻 】 1Krupinski J,Kaluza J,Kumar P,

19、 et al. Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic strokeJ.Stroke,1994,25 (9 ):1794.2金惠銘,李先濤.血管新生的調控J. 中國 微循環雜志,2001,5(2):85.3劉昭純，馬月香，劉紅杰，等 “瘀血生風”假說的形成及意義J.中國中醫基礎醫學雜志，2005，11(3)：88.4高紅莉，劉昭純 活血熄風方對局灶性腦缺血模型大鼠的保護作用J.新中醫，2008，40(2)：100.5Watson BD，Dietrich WD，Busto R，et a1 Induction of repro

20、ducible brain infarction by photo chemically initiated thrombosisJ.Ann Neurol，1985，17(5)：497.6Yang Zeng jin,Bao W li,Qiu M hong,et al. Role of Vascular endothelial growth factor in neuronal DNA damage and repair in rat brain following a transient cerebral ischemiaJ.Neurosci Res,2002,70:140.7Meister B J,Gminekich F,Bacttj F,et al. Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and it receptors