1、構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工程化心肌組織的初步研究 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 作者：王靜，郭立國，馮金升，任紅茹【摘要】【關(guān)鍵詞】 組織工程；心肌細(xì)胞；PC12細(xì)胞；共培養(yǎng)；神經(jīng)支配；神經(jīng)生長因子 Abstract：To investigate the possibility of neuronal PC12 cells being used as models to investigate the innervation of tissue-engineered cardiac tissue.Neonatal rat primary cardiacmyocytes i

2、solated with using 0.25% trypsin containing 0.04%EDTA were cocultured with the NGF induced sympathetic neuron-like PC12 cells in liquid type I collagen liquid . After that , H.E. staining , immunhistochemistry staining and transmission electron microscopy were used to evaluate it. Result showed that

3、 in the 3-D co-culture model, NGF induced PC12 cells outgrew processes which reached the surface of the cardiacmyocytes and moved along with the beat of cardiomyocytes. Their varicosities also touched with cariamyocytes.The results of our study suggest that PC12 cells is a feasible model to be used

4、in the study of neural innervation of tissue engineered cardiac tissue. And the cardiomyocytes may be innervated in this model. Key words：Tissue engineering； Cardiomyocytes； PC12;；Co-culture；Innervation； Nerve growth factor 1 引 言 神經(jīng)系統(tǒng)對機(jī)體各組織、器官及系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育過程具有重要作用。神經(jīng)系統(tǒng)使機(jī)體各部分在功能上成為整體。近年來，組織工程研究發(fā)展迅速，國內(nèi)外研究

5、人員相繼成功地體外復(fù)制了軟骨1、骨2、皮膚3以及心肌4等組織。但是，要保證組織工程化產(chǎn)品在體內(nèi)移植后的存活，充分的血液供應(yīng)和完善的神經(jīng)支配起著決定性因素。如何在構(gòu)建工程化組織的同時重建其血液供應(yīng)和神經(jīng)支配，已成為組織工程研究從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用過渡的關(guān)鍵性問題。到目前為止，工程化心肌組織的血管化5研究進(jìn)展順利，而其神經(jīng)支配研究由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性及缺乏合適的體外模型，目前尚未見報道。 心肌和其他肌肉組織一樣，神經(jīng)的有效支配在其發(fā)揮正常生理功能方面起著重要作用。Dianne6等（1991年）將胸腰部交感神經(jīng)節(jié)和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)具有腎上腺素能支配的心肌細(xì)胞的體積明顯增大，表明神經(jīng)支配有利于心肌

6、細(xì)胞的生長。李振中7等（1996年）將大鼠脊神經(jīng)節(jié)與心肌細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維終止于搏動的心肌細(xì)胞表面。上述通過二維條件下，心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果表明，神經(jīng)細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)能夠相互影響，并有利于心肌細(xì)胞的生長發(fā)育和功能的發(fā)揮。 由于原代分離培養(yǎng)的交感神經(jīng)元對體外生存環(huán)境要求較高，而NGF誘導(dǎo)后的交感神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞培養(yǎng)條件更為簡單，培養(yǎng)過程中狀態(tài)也相對穩(wěn)定。工程化心肌組織的培養(yǎng)環(huán)境主要涉及到心肌組織的生長與存活，因此很難同時滿足原代分離神經(jīng)元的生長要求。基于此，本研究選用NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞與心肌細(xì)胞在液態(tài)膠原中共培養(yǎng)作為模型，對構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工程化心肌組織進(jìn)行

7、了初步的探索性研究，以探討體外再造具有神經(jīng)支配的心肌組織工程的可行性，并為心肌組織工程的神經(jīng)支配研究提供初步的資料。 2 材料與方法 2.1 材料 22 方法 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 3結(jié) 果 3.1 相差顯微鏡下觀察的結(jié)果 相差顯微鏡下觀察，第二天即可見單個的神經(jīng)細(xì)胞長出突起，隨著時間的延長，長出突起的細(xì)胞越來越多，突起也越來越長，在心肌細(xì)胞的表面延伸（見圖1A）。心肌細(xì)胞在培養(yǎng)的第二天即可見單個細(xì)胞在跳動，第三天即可見一簇一簇的細(xì)胞在跳動，第五天神經(jīng)細(xì)胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達(dá)心肌細(xì)胞的表面并隨心肌細(xì)胞一起跳動（見圖1B）。圖1 PC12與心肌細(xì)胞在液態(tài)

8、膠原中混合培養(yǎng)的相差顯微 鏡下觀察的結(jié)果 A.神經(jīng)細(xì)胞長出的神經(jīng)突起（）分別到達(dá)心肌細(xì)胞 （）的表面(40) B.神經(jīng)細(xì)胞長出的神經(jīng)突起（）呈放射狀到達(dá)心肌 細(xì)胞的表面并隨心肌細(xì)胞一起跳動(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色結(jié)果 由于本實(shí)驗采用低密度的PC12細(xì)胞植入，因此PC12細(xì)胞分散在原代心肌細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)中。PC12細(xì)胞的核較大，而心肌細(xì)胞的核較小，核均為藍(lán)色（見圖2）。 3.3 免疫組化染色結(jié)果 采用a-肌小節(jié)肌動蛋白免疫

9、組化染色對心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，胞漿呈棕色(見圖3A)。采用NF對神經(jīng)纖維進(jìn)行免疫組化染色（見圖3B），可觀察到NF陽性的細(xì)胞胞核較大，其周圍有一些染色陰性的心肌細(xì)胞，胞核較小。 3.4 透射電鏡觀察結(jié)果 PC12細(xì)胞與新生大鼠心肌細(xì)胞在液態(tài)膠原中混合培養(yǎng)后，圖中可見心肌細(xì)胞、心肌纖維和神經(jīng)突起。N1、N2 為神經(jīng)纖維，C為心肌細(xì)胞（見圖4）。M為心肌纖維（見圖5），S為PC12與心肌細(xì)胞之間的突觸（見圖6）。4 討 論 本研究以NGF誘導(dǎo)后的交感神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞與新生大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)和體外構(gòu)建組織工程化心肌片層的研究為基礎(chǔ)，以NGF誘導(dǎo)后的交感神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞與新生大鼠新室肌細(xì)胞為種子

10、細(xì)胞，以膠原、Matrigel為支架材料，進(jìn)行構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工程化心肌片層的初步探索性研究。通過組織學(xué)、免疫組化的檢測與透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞在三維條件下，經(jīng)NGF誘導(dǎo)產(chǎn)生較長的神經(jīng)突起；PC12細(xì)胞與心肌細(xì)胞在三維條件下共培養(yǎng)，神經(jīng)細(xì)胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達(dá)心肌細(xì)胞的表面與心肌細(xì)胞一起跳動，且長出的神經(jīng)突起能與原代心肌細(xì)胞形成形態(tài)上非常疑似突觸連接的結(jié)構(gòu)。 由于各組織與器官中神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，到目前為止，組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究進(jìn)展相對比較緩慢，僅在骨組織工程的神經(jīng)支配研究中取得部分進(jìn)展，張元平等10（2005）將感覺神經(jīng)、運(yùn)動神經(jīng)分別植入組織工程骨修復(fù)兔股骨缺損，與單

11、純組織工程骨和組織工程骨中植入血管束的修復(fù)效果相比較，發(fā)現(xiàn)利用感覺神經(jīng)束植入的方法可以提高組織工程骨的成骨作用,而植入運(yùn)動神經(jīng)束卻無此作用。這項研究為組織工程骨的神經(jīng)化重建奠定了一定的基礎(chǔ)。而其它組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究則未見報道。 近年來組織工程研究領(lǐng)域發(fā)展迅速，心肌組織工程研究也取得了很大的進(jìn)展，國內(nèi)外有關(guān)心肌組織構(gòu)建物的報道日益增多，德國科學(xué)家Zimmermann 等人11（2002年）成功在體外構(gòu)建了組織工程心肌條帶，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院趙云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建出類似天然心肌的心肌條帶，并對細(xì)胞接種濃度及膠原凝膠含量與再造條件的關(guān)系進(jìn)行了深入研

12、究。上述體外培養(yǎng)的可供移植的環(huán)狀條帶給治療心臟疾患帶來了新的希望。但是，要保證工程化心肌組織在體內(nèi)移植后的存活，充分的血液供應(yīng)和完善的神經(jīng)支配起著決定性因素。 隨著心肌組織工程研究深入，以及向臨床過渡的逐漸展開，一個主要的問題就是如何使構(gòu)建的工程化心肌組織在體內(nèi)存活并迅速發(fā)揮作用。帶有血管系統(tǒng)和神經(jīng)支配的復(fù)合工程化心肌組織符合仿生學(xué)觀點(diǎn)，是理想的解決方案。關(guān)于心肌組織血液供應(yīng)的形式已有較廣泛的研究，比如, 國內(nèi)外一些實(shí)驗室應(yīng)用混合細(xì)胞構(gòu)建工程化組織的技術(shù)方法，觀察不同細(xì)胞間的相互作用對血管形成的影響, 嘗試進(jìn)行工程組織體外人工血管化，使移植后的組織盡快與宿主之間建立血液循環(huán)。Zimmerman

13、n等13（2003）發(fā)現(xiàn)，在缺血模型中，利用混有其它細(xì)胞的心肌細(xì)胞構(gòu)建的工程化心肌組織的心肌收縮力比單純由心肌細(xì)胞構(gòu)建的強(qiáng)兩倍。不僅如此，Zimmermann等14（2002）還觀察到，混合細(xì)胞構(gòu)建的工程化心肌組織，同時出現(xiàn)了初級毛細(xì)血管和大血管樣結(jié)構(gòu)。這些血管樣結(jié)構(gòu)在移植后較快與宿主建立了血液循環(huán)。 在心肌組織的神經(jīng)支配方面，由于心肌的神經(jīng)支配比較復(fù)雜，且沒有合適的體外研究模型。因此，一方面要對心臟神經(jīng)的解剖學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理學(xué)做進(jìn)一步的研究，另一方面應(yīng)對心肌組織工程神經(jīng)支配的方式進(jìn)行必要的探索，以便加快心肌組織工程向臨床的應(yīng)用。雖然近年來心肌組織工程血管化研究發(fā)展迅速，但是，到目前為止，心肌

14、組織工程的神經(jīng)支配研究尚未見報道。本研究是在以往研究的基礎(chǔ)上，首次對工程化心肌組織的神經(jīng)支配進(jìn)行探索性研究。【參考文獻(xiàn)】 1Masuda K,HejnaMJ, HejnaMJ.A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by muture bovine chondrocytes:the alginate-recovered-chondrocyte(ARC)methodJ. Journal of Orthopaedic Research,2003,21:139-148.2Devin JE,Lau

15、rencin CT, Laurencin CT .Three-dimensional deg 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 3結(jié) 果 3.1 相差顯微鏡下觀察的結(jié)果 相差顯微鏡下觀察，第二天即可見單個的神經(jīng)細(xì)胞長出突起，隨著時間的延長，長出突起的細(xì)胞越來越多，突起也越來越長，在心肌細(xì)胞的表面延伸（見圖1A）。心肌細(xì)胞在培養(yǎng)的第二天即可見單個細(xì)胞在跳動，第三天即可見一簇一簇的細(xì)胞在跳動，第五天神經(jīng)細(xì)胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達(dá)心肌細(xì)胞的表面并隨心肌細(xì)胞一起跳動（見圖1B）。圖1 PC12與心肌細(xì)胞在液態(tài)膠原中混合培養(yǎng)的相差顯微 鏡下觀察的結(jié)果 A.神經(jīng)細(xì)胞長出的神經(jīng)突

16、起（）分別到達(dá)心肌細(xì)胞 （）的表面(40) B.神經(jīng)細(xì)胞長出的神經(jīng)突起（）呈放射狀到達(dá)心肌 細(xì)胞的表面并隨心肌細(xì)胞一起跳動(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色結(jié)果 由于本實(shí)驗采用低密度的PC12細(xì)胞植入，因此PC12細(xì)胞分散在原代心肌細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)中。PC12細(xì)胞的核較大，而心肌細(xì)胞的核較小，核均為藍(lán)色（見圖2）。 3.3 免疫組化染色結(jié)果 采用a-肌小節(jié)肌動蛋白免疫組化染色對心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，胞漿呈棕色(見圖3A)。采用NF對神經(jīng)

17、纖維進(jìn)行免疫組化染色（見圖3B），可觀察到NF陽性的細(xì)胞胞核較大，其周圍有一些染色陰性的心肌細(xì)胞，胞核較小。 3.4 透射電鏡觀察結(jié)果 PC12細(xì)胞與新生大鼠心肌細(xì)胞在液態(tài)膠原中混合培養(yǎng)后，圖中可見心肌細(xì)胞、心肌纖維和神經(jīng)突起。N1、N2 為神經(jīng)纖維，C為心肌細(xì)胞（見圖4）。M為心肌纖維（見圖5），S為PC12與心肌細(xì)胞之間的突觸（見圖6）。4 討 論 本研究以NGF誘導(dǎo)后的交感神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞與新生大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)和體外構(gòu)建組織工程化心肌片層的研究為基礎(chǔ)，以NGF誘導(dǎo)后的交感神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞與新生大鼠新室肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，以膠原、Matrigel為支架材料，進(jìn)行構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工

18、程化心肌片層的初步探索性研究。通過組織學(xué)、免疫組化的檢測與透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞在三維條件下，經(jīng)NGF誘導(dǎo)產(chǎn)生較長的神經(jīng)突起；PC12細(xì)胞與心肌細(xì)胞在三維條件下共培養(yǎng)，神經(jīng)細(xì)胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達(dá)心肌細(xì)胞的表面與心肌細(xì)胞一起跳動，且長出的神經(jīng)突起能與原代心肌細(xì)胞形成形態(tài)上非常疑似突觸連接的結(jié)構(gòu)。 由于各組織與器官中神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，到目前為止，組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究進(jìn)展相對比較緩慢，僅在骨組織工程的神經(jīng)支配研究中取得部分進(jìn)展，張元平等10（2005）將感覺神經(jīng)、運(yùn)動神經(jīng)分別植入組織工程骨修復(fù)兔股骨缺損，與單純組織工程骨和組織工程骨中植入血管束的修復(fù)效果相比較，發(fā)現(xiàn)利用感覺

19、神經(jīng)束植入的方法可以提高組織工程骨的成骨作用,而植入運(yùn)動神經(jīng)束卻無此作用。這項研究為組織工程骨的神經(jīng)化重建奠定了一定的基礎(chǔ)。而其它組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究則未見報道。 近年來組織工程研究領(lǐng)域發(fā)展迅速，心肌組織工程研究也取得了很大的進(jìn)展，國內(nèi)外有關(guān)心肌組織構(gòu)建物的報道日益增多，德國科學(xué)家Zimmermann 等人11（2002年）成功在體外構(gòu)建了組織工程心肌條帶，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院趙云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建出類似天然心肌的心肌條帶，并對細(xì)胞接種濃度及膠原凝膠含量與再造條件的關(guān)系進(jìn)行了深入研究。上述體外培養(yǎng)的可供移植的環(huán)狀條帶給治療心臟疾患帶來了新的希望。但是，要保證工程化心肌組織在體內(nèi)移植后的存活，充分的血液供應(yīng)和完善的神經(jīng)支配起著決定性因素。 隨著心肌組織工程研究深入，以及向臨床過渡的逐漸展開，一個主要的問題就是如何使構(gòu)建的工程化心肌組織在體內(nèi)存活并迅速發(fā)揮作用。帶有血管系統(tǒng)和神經(jīng)支配的復(fù)合工程化心肌組織符合仿生學(xué)觀點(diǎn)，是理想的解決方案。關(guān)于心肌組織血液供應(yīng)的形式已有較廣泛的研究，比如, 國內(nèi)外一些實(shí)驗室應(yīng)用混合細(xì)胞構(gòu)建工程化組織的技術(shù)方法，觀察不同細(xì)胞間的相互作用對血管形成的影響, 嘗試進(jìn)行工程組織體外人工血管化，使移植后的組織盡快與宿主之間建