1、微生物限度檢查方法學驗證一、檢驗方法依據微生物計數法（中國藥典2015年版四部1105）;控制菌檢查法（中國藥典2015 年版四部1106）;非無菌藥品微生物限度標準（中國藥典 2015年版四部1107）;抑菌效 力檢查法（中國藥典2015年版四部1121）檢查。二、菌種、培養基及稀釋液表1菌種菌種名稱菌種代數菌種狀態廠家大腸埃希菌CMCC(B)441023正常金黃色葡萄球菌CMCC（B）260033正常枯草芽抱桿菌CMCC（B）635013正常浙江省食品藥品檢驗白色念珠菌CMCC(F)980013正常研究院黑曲霉CMCC(F)980033正常乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）500943正常表2

2、培養基培養基名稱批號廠家營養肉湯培養基150222北京三藥科技開發公司改良馬丁培養基150134北京三藥科技開發公司改良馬丁瓊脂培養基150215北京三藥科技開發公司營養瓊脂培養基150317北京三藥科技開發公司玫瑰紅鈉瓊脂培養基150323北京三藥科技開發公司膽鹽乳糖培養基150127北京三藥科技開發公司膽鹽硫乳瓊脂培養基150214北京三藥科技開發公司四硫磺酸鈉亮綠培養基150416北京三藥科技開發公司MUG口養基150122北京三藥科技開發公司曙紅亞甲監瓊脂培養基150137北京三藥科技開發公司二糖鐵瓊脂培養基150207北京三藥科技開發公司表3對照用培養基對照培養基名稱批號廠家營養肉湯

3、對照培養基135004-201103中國食品藥品檢定研究院營養瓊脂對照培養基135003-201002中國食品藥品檢定研究院玫瑰紅鈉瓊脂對照培養基135005-201002中國食品藥品檢定研究院膽鹽乳糖對照培養基135006-201404中國食品藥品檢定研究院膽鹽硫乳瓊脂對照培養基135010-201102中國食品藥品檢定研究院四硫磺酸鈉亮綠對照培養基135020-201101中國食品藥品檢定研究院MUG寸照培養基135012-201001中國食品藥品檢定研究院曙紅亞甲監瓊脂對照培養基135009-201102中國食品藥品檢定研究院三糖鐵瓊脂對照培養基表4試劑試劑名稱批號級別磷酸二氫鉀1308

4、26分析純氫氧化鈉20150117分析純氯化鈉20140714分析純聚山梨酯8020141011化學純95% 醇15070722藥用級二甲氨基苯甲醛20140402分析純鹽酸20140533分析純稀釋液：(1) pH6.8緩沖液取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液 250ml,加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml,用水稀釋至 1000ml,搖勻，既得。(2) 0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml,過濾，分裝、滅菌。(3) 0.05 %( ml/ml )聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液取聚山梨酯80 0.5ml ,用0.9 %無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至 1000m

5、l,濾過，分裝, 滅菌，備用。(4) 靛基質試液取對二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%L醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml 徐徐滴入。三、菌液的制備1 細菌、霉菌、酵母菌接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，培養 24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基上，培養48 小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50100cfu的菌懸液備用。接 種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養 7 天，加入 5ml 含 0.05（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，然后吸出抱子懸液

6、（用帶 有無菌棉花的能過濾菌絲的無菌毛細吸管）用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含孢子 數 50100cfu 的抱子懸液。 菌液制備后若在室溫下放置， 應在 2 小時內使用， 若保存在 28°C可在24小時內使用。2 控制菌接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養物至營養肉湯培 養基中，培養 24小時。用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數為 10100cfu 的菌懸 液。菌懸液在室溫下放置應在 2小時內使用，若保存在28C可在24小時內使用。四、驗證內容1 、計數方法驗證將制備好的菌懸液用 0.9%無菌氯化鈉溶液以每 10倍體積分別稀釋成一系列濃

7、度菌 懸液，利用血球計數板計數， 確定具體菌懸液濃度， 取接近于 10cfu-100cfu 的稀釋濃度， 選取各項試驗項下的規定濃度進行實驗。稀釋及觀察均應在陽性室內完成。經過驗證當原液稀釋至 10-6時，菌液濃度接近 100cfu/ml。2、適用性檢查2.1 細菌、霉菌、酵母菌取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各1ml（內含菌約50100cfu）,分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，混勻， 凝固，置3035C培養48小時，計數；取白色念珠菌、黑曲霉1ml（內含菌約50100cfu）, 注入無菌平皿中（取用黑曲霉時應注意自身安全） ，立即傾注玫瑰

8、紅鈉瓊脂培養基，每 株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2328C培養72小時，計數。同時，用 相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗，作為對照。其大小、形態應與對照培 養基一致，且數量應不小于對照培養基的 70%。細菌、霉菌及酵母菌培養基適用性檢查培養基名稱菌種名稱測試培養基（cfu）對照培養基（cfu）回收率（%）大小形態標準結論才口/J、碟1碟2平均碟1碟2平均營養瓊脂拉H甘 培養基枯草芽抱桿菌87838595999787.6一致大小形態一致且回收率70%符合規定金黃色 葡萄球 菌88828594989688.5一致大小形態一致且回收率70%符合規定大腸埃希菌838684.595

9、959588.9一致大小形態一致且回收率70%符合規定玫瑰紅鈉拉H甘 培養基枯草芽抱桿菌848785.5999496.588.6一致大小形態一致且回收率70%符合規定金黃色 葡萄球 菌908688971019988.9一致大小形態一致且回收率70%符合規定大腸埃希菌888385.5929995.589.5一致大小形態一致且回收率70%符合規定培養基中細菌、霉菌、酵母菌的生長情況良好，回收率在80%，且與對照培養基狀態一致，證明此批次培養基可以準確的檢測出相應微生物情況。2.2控制菌 2.2.1促生長能力取大腸埃希菌菌懸液0.1ml （內含菌約10100cfu）,分別置于膽鹽乳糖培養基、MUG

10、培養基、營養肉湯培養基中；取乙型副傷寒沙門菌0.1ml （內含菌約10100cfu）,分別接 種于營養肉湯培養基、四硫磺酸鈉亮綠培養基，取乙型副傷寒沙門菌0.1ml （內含菌約10 100cfu）涂布于膽鹽硫乳瓊脂培養基、曙紅亞甲藍瓊脂培養基中；于35C培養18小時，同 時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗，作為對照，每個培養基平行制 備2個平皿。膽鹽乳糖培養基、營養肉湯培養基、MUG培養基與對照管比較，被檢培養 基管試驗菌應生長良好；膽鹽硫乳瓊脂培養基、曙紅亞甲藍瓊脂培養基與對照培養基上生 長的菌落大小、形態特征應一致。2.2.2抑制能力取金黃色葡萄球菌100 cfu左右，注入無

11、菌平皿中，立即傾注膽鹽乳糖培養基、四硫磺酸鈉亮綠培養基，每個培養基平行制備2個平皿，混勻，凝固，置35T培養18小時，應 不得有菌生長。223指示能力取乙型副傷寒沙門菌10100cfu，接種于三糖鐵瓊脂培養基中，每個培養基平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035C培養18小時；膽鹽硫乳瓊脂培養基、曙紅亞甲藍瓊脂 培養基指示能力見2.2.1中乙型副傷寒沙門菌測試結果，MUG培養基指示能力見2.2.1中大 腸埃希菌測試結果。與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌生長的菌落大小、形態特 征、指示劑反映情況等應與對照培養基一致。控制菌培養基適用性檢查培養基名稱促牛長性 （與對照比較）抑制性（與對照比較

12、） 金黃色平葡萄球菌指示性（與對照比較） 乙型副傷寒沙門菌結論菌種名稱形態大小形態大小指示 反應膽鹽乳糖培養基大腸埃希菌一致一致無生長-符合 規定MUG培養基大腸埃希菌一致一致-一致一致一致符合 規定營養肉湯培養 基大腸埃希菌一致一致-符合 規定乙型副傷寒 沙門菌一致一致-符合 規定四硫磺酸鈉亮綠培養基乙型副傷寒 沙門菌一致一致無生長-符合 規定膽鹽硫乳瓊脂培 養基乙型副傷寒 沙門菌一致一致-一致一致一致符合 規定曙紅亞甲藍瓊脂培養基乙型副傷寒 沙門菌一致一致-一致一致一致符合 規定三糖鐵瓊脂培養 基-一致一致一致符合 規定培養基的促生長性及指示性菌落生長狀態一致，抑制性均無菌落生長，說明培養

13、基 適用性良好。3、抑菌性：取連續生產的三批樣品進行測定3.1細菌、霉菌、酵母菌3.1.1供試液的制備：稱取本品10g，加pH6.8緩沖液100ml,混勻，制成1: 10的供試 液。3.1.2試驗組：取大腸埃希菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和枯草芽抱桿菌菌懸液各1ml，分別加上述供試液1ml，注入平皿中，立即傾注1520ml溫度不超過45C溶化的營養瓊脂培養基培養，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。31.3菌液組：取上述各試驗菌液1ml，加入相應的培養基培養，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。3.1.4供試品對照組：取供試液1ml，分別注入1520ml溫度不超過45

14、C溶化的營養瓊 脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基培養，每個培養基平行制備2個平皿。3.1.5回收率標準以供試品對照組為樣品空白（Co）、以菌液組為對照（T）、以試驗組為測試品（C）計：（C-Co）/T > 70%細菌、霉菌及酵母菌抑菌性檢測結果統計批號培養基名稱菌種培養時間（h）菌液組菌數Cfu試驗組菌數Cfu供試品對照組菌數回收率%數值平均數值平均數值平均150804營養瓊脂培養基枯草芽抱桿菌7284869092.581095.9728895金黃色葡萄球菌7286849391.597.072829012大腸埃布困728485.5919295.9728793玫瑰紅鈉培養基枯草芽抱桿菌1208

15、686.584850098.31208786金黃色葡萄球菌1208787.5858698.312088870大腸埃布困1208785.5838397.11208483150805營養瓊脂培養基枯草芽抱桿菌7288859592.56597.1728690金黃色葡萄球菌728584.59593.595.57284924大腸埃布困728184.58991.597.7728794玫瑰紅鈉培養基枯草芽抱桿菌12083858787.50097.11208788金黃色葡萄球菌12086848886.597.112082850大腸埃布困1208884868895.51208090150806營養瓊脂培養基枯草

16、芽抱桿菌728785.59495.56695.5728497金黃色葡萄球菌728386969695.67289966大腸埃布困728585.5959695.0728697玫瑰紅鈉培養基枯草芽抱桿菌120848485870096.61208489金黃色葡萄球菌1208585.5908996.112086880大腸埃布困1208283.5898796.01208585通過連續三批次不同種菌類的加樣，回收率均在90%以上，說明本產品對于細菌、霉菌及酵母菌不具備抑菌性。3.2控制菌3.2.1大腸埃希菌取10 ml供試液(制備方法同3.1.1)及大腸埃希菌菌懸液1ml(10100cfu)加入膽鹽 乳糖培

17、養基100ml，于35C培養24小時。取上述培養物0.2ml，接種至含5ml MUG培養 基的試管內，培養，于5小時、24小時在366nm紫外燈下觀察，同時用未接種的MUG培 養基作本底對照。觀察后，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液。紫外燈照射時管內培養 物呈現熒光，為MUG陽性；不呈現熒光，為MUG陰性；加入靛基質試液時液面呈玫瑰 紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，為靛基質陰性。322沙門氏菌取10 ml供試液（制備方法同3.1.1）及乙型副傷寒沙門菌1ml（10100cfu）,直接接 種至200ml的營養肉湯培 養基中，混勻，于35°C培養培養24小時，取上述培養物1ml， 接種于

18、10ml四硫磺酸鈉亮綠培養基中，35C培養24小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊 脂培養基和曙紅亞甲藍瓊脂培養基的平板上，35C培養24小時。3.3合格標準若上述試驗檢測出試驗菌，則按此供試液制備方法和控制菌檢查方法進行供試品的 該控制菌檢查。控制菌抑菌性檢查大腸埃布困試驗組（+/-）陰性對照組（+/-）MUG+ +- -靛基質+ +- -沙門氏菌試驗組（+/-）陰性對照組（+/-）四硫磺酸鈉亮綠培養基+ +- -膽鹽硫乳瓊脂培養基+ +- -曙紅亞甲監瓊脂對照培養基+ +- -三糖鐵瓊脂對照培養基+ +- -經控制菌的驗證，當樣品被1:10稀釋時，本品不具有抑菌性，可以直接采用平皿法進 行檢驗而不對檢測結果造成假陰性的影響。五、本品微生物限度檢查方法的確定綜上所述，本品細菌、霉菌及酵母菌檢查采用常規平皿法，取1: