1、    伽瑪刀不同劑量照射正常大鼠一側尾殼核后 延髓內Fos蛋白的表達及變化         摘要：目的觀察-刀不同劑量照射正常大鼠一側尾殼核后3個月，遠離靶區的延髓中尾段內Fos的表達和變化及與劑量的關系。方法分別用10Gy至100Gy 10個級別劑量照射大鼠一側尾殼核，3個月后，用ABC法對延髓中尾段切片進行抗Fos蛋白的免疫組織化學反應。結果在延髓內臟帶、三叉神經尾側亞核、三叉神經間質核、延髓背側網狀核和下橄欖核等處出現多少不等的Fos陽性胞核，隨著劑量的增加

2、Fos陽性胞核的數量增加，范圍擴大。在高劑量組的延髓腹外側區出現3種Fos陽性細胞：胞核陽性、胞漿陰性；胞漿陽性、胞核陰性；胞核胞漿均為陽性。結論-刀照射前腦一個局部，在遠離靶區的延髓中尾段出現Fos陽性反應，并與劑量成正相關。關鍵詞：-刀；延髓；Fos；延髓內臟帶；免疫組織化學分類號：R8文獻標識碼：A文章編號：0529-1356(2000)01-21EXPRESSION AND CHANGE OF Fos IN THE MEDULLAOBLONGATA OF RAT FOLLOWING EXPOSURE TOVARIOUS DOSE OF GAMMA KNIFERAO Zhi-ren(In

3、stitute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)WU Sheng-ling(Guang dong Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)QIU Jian-yong(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)XU Xin(Guang don

4、g Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)DUAN Xiao-qin(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)JU Gong(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)Abstract：ObjectiveTo observe

5、alterations in Fos protein expression in middle-caudal segment of the normal rat medulla oblongata after the unilateral caudate putamen nucleus was irradiated with different dosage of gamma knife.MethodsThe caudate putamen nucleus was irradiated with various dosage from 10Gy to 100Gy of gamma knife.

6、The rats were sacrificed 3 months after irradiation and fixed and cut with cryostat.The sections of the medulla oblongata were reacted with anti-Fos protein immunohistochemical ABC method.ResultsAt low dosage,Fos positive nucleus was observed in medullary visceral zone,caudal subnucleus of trigemina

7、l nerve,intertrigeminal nucleus of trigeminal nerve,dorsal medullary reticular nucleus and inferior olive nucleus.With the dosage increasing,both the number and distribution scope of positive nucleus was increased.In the high dosage group,three types of Fos positive expression appeared in ventrolate

8、ral medulla oblongata nucleus.The three types were:only the nucleus was stained;only cytoplasm was stained;both nucleus and cytoplasm were stained.ConclusionThough a local nucleus in the forebrain was exposed to gamma knife,the distant area of middle-caudal segment of the medulla oblongata showed Fo

9、s positive reaction and the reaction was positively related with dosage.Key words：Gamma knife;Medulla oblongata;Fos;Medullary visceral zone;Immunohistochemistry-刀定位照射是某些顱內疾病(腦血管畸形、腦腫瘤及腦功能性疾病)的非手術治療方法之一。有關-刀的放射神經生物學的基礎研究雖有一些報告，但仍比較薄弱，Kandziolka等13曾做過比較系統的觀察，他曾用-刀(30、40、50、60、70、80、100、150、200Gy)定位照射一

10、側尾狀核頭部，動物成活90d后靶區的組織學變化，結果照射劑量少于70Gy，在光鏡下未見到組織學的改變；在70100Gy發現神經元的大小與形態有變化，小動脈壁增厚，血紅細胞或蛋白滲出血管外，并有點狀壞死；150200Gy照射后17d腦未出現病理學改變，14d出現靶區的腦水腫，21d后靶區出現一直徑為4mm的壞死。這一結果初步提示了靶區腦組織的變化與劑量及成活時間的關系，由于他們只是用組織學方法僅觀察了靶區組織的變化，說明的問題很局限，因此有必要對-刀照射正常大鼠腦部后，腦組織的變化進行更深入的研究。為此我們進行了兩方面的工作，第1用100Gy劑量的-刀照射正常大鼠一側尾狀核頭部，動物分別成活0.

11、5、1、3、6、12h及1、3、7、14、30和90d后，采用組織學方法(HE染色)，組織化學方法(NADPH-diaphorase染色)，抗Fos蛋白，抗GFAP，抗0x42，和抗HSP70等免疫組織化學技術，觀察全腦(包括靶區和非靶區)血管內皮，神經元，星形膠質細胞和小膠質細胞的變化及其與時間的效應關系。第2用10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Gy的-刀照射正常大鼠一側尾狀核頭部，動物均成活90d，采用上述方法觀察全腦組織的變化及其劑量的效應關系。我們僅就用10Gy至100Gy不同劑量的-刀照射后延髓內Fos蛋白的表達及變化作一報告，其他結果另行報告(請參閱“全國

12、首屆微侵襲神經外科學術會議論文匯編”，廣州，1998：66119)。材料和方法共用SD成年雄性大鼠(體重200g)34只，其中實驗組30只，對照組4只。1.實驗組2.對照組和對照實驗2.1正常對照組：2只正常大鼠未經MRI和-刀處理，在深麻下按實驗組方法對動物進行灌流固定、切片和免疫組織化學反應。2.2對照實驗：大鼠2只在麻醉下固定于專用固定架上，放在-刀室(不受-刀直接照射)30min，動物成活90d按實驗組步驟灌流固定，切片和免疫組織化學反應。2.3替代實驗：隨機抽取實驗組切片若干，用KPBS替代第一抗體，浸泡切片48h(4)，其余步驟與實驗組相同。結果未見到Fos陽性產物。結果1.正常對

13、照組和對照實驗僅在延髓內臟帶(MVZ)的孤束核(NTS)和腹外側延髓(VLM)有少數散在的Fos陽性胞核，其他部位為陰性。2.實驗組為了敘述方便，我們參照有關文獻1，2將照射劑量分為3個劑量級，即低劑量級(1030Gy)，中劑量級(4060Gy)和高劑量級(70100Gy)。2.1低劑量組(1030Gy)：Fos陽性胞核出現在下列結構，(1)MVZ中有少量Fos陽性胞核，主要分布于NTS的內側亞核(1)，VLM的表面和腹外側網狀核(2)，而MVZ中間部(IRt)則較少。MVZ內Fos陽性胞核的數量詳見表1。(2)雙側延髓背側網狀核內有Fos表達(3)。(3)三叉神經尾側亞核(Sc5)有少量Fo

14、s胞核，以淺層為主，其他層均散在出現，照射側多于非照射側；三叉神經極間亞核以上部位則明顯減少。(4)雙側三叉神經束間核也有少量Fos陽性胞核。    110Gy照射后，最后區平面MVZ內孤束核(NTS)的Fos表達×100(下同)Fig.1Expression of Fos in NTS of MVZ at area postrema (AP) level of rat after irradiating with 10Gy of gamma knife. ×100(The same as follows)  &#

15、160; 210Gy照射后，最后區平面MVZ內腹外側延髓(VLM)的Fos表達Fig.2Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 10Gy    310Gy照射后，延髓背側網狀核的Fos表達Fig.3Expression of Fos in the dorsal reticular nucleus of the medulla oblongata of rat after irradiating with 10Gy表1低劑量組(1030Gy

16、)9只大鼠MVZ內Fos陽性胞核的計數Table 1Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=9) irradiated by low-dose(10-30Gy)錐體交叉平面Pyr.level最后區平面AP.level閂平面Obex.level閂吻側平面rostal levelto obexNTS503852206108IRt901637870VLM8071 053402280總數total1 4002 068986458均數/只average/per rat155.5229.7109.550.9  

17、60;  2.2中劑量組(4060Gy)，上述區域內的Fos陽性胞核有所增加，(1)MVZ的NTS、VLM和IRt Fos陽性胞核增加明顯，形成一條弧形帶狀分布區，在VLM，Fos陽性胞核分布于表面，外側網狀核小細胞部，腹外側網狀核和三叉下核(46)。MVZ內的Fos陽性胞核計數詳見表2。(2)三叉神經尾側亞核Fos陽性胞核有增加，仍以照射側較多。(3)雙側延髓背側網狀核有較多的Fos陽性胞核，位于NTS之腹外側，IRt背外側與三叉神經尾側亞核背側之間。    450Gy照射后，閂平面MVZ內NTS的Fos表達Fig.4Expression o

18、f Fos in NTS of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy    550Gy照射后，閂平面MVZ內中間網狀帶(IRt)的Fos表達Fig.5Expression of Fos in IRt of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy    650Gy照射后，閂平面MVZ內VLM的Fos表達Fig.6Expression of Fos in VLM of M

19、VZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy表2中劑量組(4060Gy)9只大鼠MVZ內Fos陽性胞核的計數Table 2Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=9) irradiated by mid-dose(40-60Gy)錐體交叉平面Pyr.level最后區平面AP.level閂平面Obex.level閂吻側平面rostal levelto obexNTS8031 252406214IRt26146017898VLM1 0741 603504381總數

20、total2 1383 3151 188693均數/只average/per rat237.5268.3132.077     2.3高劑量組(70100Gy)，Fos表達的主要特點如下：(1)MVZ內Fos陽性胞核明顯增多，形成一條弧形帶狀區。NTS的Fos陽性胞核主要分布于弧束周圍(7)；VLM的Fos陽性胞核散在分布于VLM各結構(8)；IRt有較多的散在Fos陽性胞核(9)。從錐體交叉平面至閂吻側平面，Fos陽性胞核有所減少。MVZ內Fos陽性胞核計數詳見表3。(2)雙側三叉神經尾側亞核有較多的Fos陽性胞核，淺層較密集，深部各層也有散在分布；極

21、間亞核以前偶見Fos胞核。(3)雙側三叉脊束束間核有少量Fos陽性胞核。(4)雙側外側楔束核、下橄欖核有少量Fos陽性胞核。(5)雙側延髓背側網狀核有較密集的Fos陽性胞核。(6)在VLM觀察3種Fos陽性細胞(神經元或神經膠質細胞)，即Fos陽性胞核，胞漿為陰性；Fos陽性胞漿，胞核為陰性；胞漿和胞核均為Fos陽性(1012)。    770Gy照射后，最后區平面MVZ內NTS的Fos表達Fig.7Expression of Fos in NTS of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy

22、    870Gy照射后，最后區平面MVZ內IRt的Fos表達Fig.8Expression of Fos in IRt of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy    970Gy照射后，最后區平面MVZ內VLM的Fos表達Fig.9Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy    1070Gy照射

23、后，VLM內3種Fos陽性細胞，. 胞核陽性者；. 胞漿陽性者；. 胞核胞漿均陽性者×200Fig.10Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70GyFos positive only in nuclei of cells, Fos positive only in cytoplasm,Fos positive in both nuclei and cytoplasm.×200(The same as follows)    117

24、0Gy照射后，VLM內胞核胞漿均Fos陽性細胞×200Fig.11Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70GyFos positive only in nuclei of cells, Fos positive only in cytoplasm,Fos positive in both nuclei and cytoplasm.×200(The same as follows)    1270Gy照射后，VLM內Fos陽性細胞&

25、#215;200Fig.12Fos positive cells in VLM after irradiating with 70Gy×200表3高劑量組(70100Gy)12只大鼠MVZ內Fos陽性胞核的計數Table 3Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ ofthe rat (n=12) irradiated by hight-dose(70-100Gy)錐體交叉平面Pyr.level最后區平面AP.level閂平面Obex.level閂吻側平面rostal levelto obexNTS1 2411 867608364IRt582

26、872378116VLM1 5082 043784420總數total3 3314 7821 770950均數/只average/per rat277.5498.5147.570.8     總之，從低劑量至高劑量延髓內Fos陽性細胞數量增加，分布范圍也逐漸擴大；MVZ是一個敏感區，Fos陽性細胞較密集，特別是NTS和VLM，在錐體交叉平面和最后區平面Fos陽性胞核較多，向吻側至閂平面和閂吻側平面Fos表達有所減少；雙側三叉神經尾側亞核有Fos表達，極間亞核以吻部位則極少；在高劑量組可見到3種Fos陽性細胞。 討論1.關于刀照射大鼠腦部模型的建立1.1靶

27、區位置的選定，本實驗將靶區定于尾狀核頭部，其理由如下：(1)由于所用-刀裝置是用于人腦的，最小的準直器直徑為4mm,這就決定了射線集中照射中心區，直徑最小為4mm，大鼠腦內僅尾狀核頭部較大超過4mm，結構比較單一，其他區域結構復雜，涉及的核團較多，增加了對結果解釋的難度；(2)由于大鼠腦子小，在MRI掃描上只有尾狀核頭部易于辨識；(3)國外已有學者用此作為靶區2。1.2照射劑量，我們選定從10Gy到100Gy的10個等級劑量，臨床治療用的劑量在此范圍內3，雖然有的學者在動物實施過150Gy和200Gy的照射，遠遠超過了臨床的實際用量，故未選用。1.3動物的成活時間，我們參考有關文獻13將-刀照

28、射后，腦組織的放射神經生物學效應分為早期(即照后90d以內)，中期(照后90d至1年)和長期(照后1年以上)。我們觀察的是早期變化。2.關于Fos蛋白的表達及其意義2.1Fos蛋白表達顯示技術的優缺點c-fos早期原癌基因(c-fos proto oncogene)是存在于細胞內的第三信使，當受到刺激時，大多數細胞的反應是c-fos mRNA和Fos蛋白的早期表達。用原位分子雜交技術顯示胞漿內的c-fos mRNA，用免疫組織化學方法顯示胞核內的Fos蛋白。c-fos mRNA和Fos蛋白的顯示技術作為神經系統的機能形態學方法已被廣泛地采用4，5，6。當機體受到刺激時，神經系統與此機能相關的多

29、級神經元可能出現陽性表達，而且非常敏感，這是其優點。由于任何刺激均能引起相應神經元的c-fos表達，因此如何保證c-fos表達的特異性是至關重要的46。我們對實驗條件進行了嚴格控制，盡量減少無關刺激對動物的影響，并設置了對照組，從而保證結果的可靠性。2.2-刀照射后腦內Fos陽性表達及其意義-刀照射后除靶區出現Fos陽性細胞外，在全腦某些非靶區部位(例如：皮質、側腦室周圍的白質、海馬以及下丘腦、杏仁中央核和延髓)也出現Fos陽性細胞，并顯示出與照射劑量和成活時間的相應關系，有關結果另有報告7，故不贅述。我們發現在大劑量(70100Gy)照射或照后較長時間成活(3個月)后出現3種Fos陽性細胞，

30、即(1)胞核陽性，胞漿陰性；(2)胞核陰性，胞漿陽性；(3)胞核、胞漿均為陽性。我們認為(1)為正常反應細胞，(2)是嚴重受損細胞，(3)是中間過渡性細胞，并專題作了報告8，在此不重復。我們主要討論-刀照射尾狀核頭部后延髓內Fos表達及其變化的意義。延髓內臟帶(MVZ)是一個位于延髓中尾段，從背內側，穿經網狀結構至腹外側延髓(VLM)的弧形帶狀區，呼吸中樞、心血管中樞等均位于MVZ內，MVZ參與應激反應的調節，各種傷害性刺激(胃腸、心血管、軀體、內分泌、免疫刺激)均引起MVZ內神經元的Fos表達，關于MVZ的結構與機能，請參閱Rao和Ju的綜述9。-刀照射腦部，造成靶區腦組織的損傷，細胞變性、凋亡或壞死，因此靶區組織又形成了一個新的傷害性刺激源，通過神經傳導或神經體液途徑引起應激反應，MVZ內細胞產生不同程度Fos表達。隨著照射劑量的增加，靶區組織的損傷也加重，應激反應也隨之加強，Fos陽性細胞增多。錐體交叉平面和最后區平面MVZ內Fos陽性胞核密集，向吻側至閂平面和閂吻側