1、doi:10.3969/j.issn.1006-4907.2013.03.001現有豬圓環病毒2型疫苗以及新型疫苗的研究進展屈泰龍，李潤成.（湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙410128）摘要：豬圓環病毒病是近幾年來對養豬業威脅較大的傳染性疾病之一，時傳染性疾病的防技主要是通過疫苗免疫來實現。本文對目前商品化以及實驗性豬圓環病毒疫苗的研究概況進行了介紹，以期為現有PCV2商品我苗的臨床選用提供參考，并為養豬人增強對PCV2新型疫苗的了解提供材料。關鍵詞：豬圓環病毒2型；疫苗；進展中圖分類號:S852.5;S858.28文獻標識碼:A文章編號：1006-4907(2013)03-0001-03基

2、金項目：2010-2013年長沙市校產學研合作產業化培育項目（¥）00046-173）作者簡介：屈泰龍（1986",男，河南廚氏人，在讀碩士，研究方向：動物病原分子學與免疫學，E-mail:qutalong。通訊作者：李潤成。豬圓環病毒病是由豬圓環病毒2型（PCV2）引起的豬的一種免疫抑制性疾病，主要引起以患豬全身性淋巴結腫大為特征的多系統功能衰竭性疾病，臨床上表現為體質下降、消瘦、貧血、淋巴結腫大壞死、黃疸、皮炎、腹瀉和呼吸困難、繁殖障礙等叫自1991年加拿大首次發現該病后明逐漸在美洲，歐洲（德國）以及亞洲（韓國，中國）發現該病叫我國自2000年郎洪武首次發現該病后，研究

3、人員對豬群進行流行病學調查結果顯示,PCV2抗體陽性率高達80%以上，被調查的豬場陽性率達100%,尚未發現有抗體陰性豬場存在叫給健康養豬帶來了較大的壓力。豬圓環病毒2型（PCV2）有11個ORF,其編碼的蛋白由2ku-36ku不等，其中研究的較為深入的為ORF1.ORF2和ORF3,分別編碼病毒復制相關蛋白Rep和Rep'、病毒結構蛋白Cap以及病毒感染細胞凋亡相關的蛋白。Cap為PCV2的主要結構蛋白，可誘導動物體產生免疫反應，是PCV2的主要免疫保護性抗原，是研制亞單位疫苗的目標抗原以句。預防豬圓環病毒并的關鍵性技術為疫苗免疫。國內外學者就圓環病毒疫苗的研究進行了諸多探索，目前已

4、經商品化的疫苗有滅活苗、亞單位疫苗以及PCV1-PCV2嵌合型疫苗,這些疫苗對于豬圓環病毒的防控起到了關鍵性的作用。近年來隨著分子生物技術手段的發展，對圓環病毒疫苗的研究又進入了一個新的階段，比如：核酸疫苗、載體疫苗、表位疫苗以及合成肽疫苗等，本文就近年來豬圓環病毒疫苗研究進展作一闡述，以期為疫苗使用和新型疫苗的開發提供-定參考。1傳統疫苗1.1滅活疫苗滅活苗是指將接種有PCV2的細胞培養物經過理化手段處理，使其喪失感染性但保留免疫原性，添加佐劑經乳化后制備而成。該類疫苗無毒,易于保存，性能穩定。滅活疫苗能夠有效的預防圓環病毒病的發生,國外學者較早投入到PCV2滅活疫苗的研究中。法國Meria

5、l公司早在2004年就已經開發出了PCV2全病毒滅活疫苗-Circovaco母豬以及3周齡以上的仔豬均可使用該疫苗。法國的田間試驗顯示，妊娠母豬免疫后,仔豬通過吮吸初乳獲得母源抗體，可以降低仔豬病毒血癥以及淋巴結損傷在德國的233個豬場的哺乳豬，斷奶仔豬以及育肥豬進行的免疫實驗中發現，免疫Circovac的豬群比沒免疫豬群的死亡率分別下降了2.9%.4.8%和2.6%可見該疫苗能夠獲得較穩定的免疫力，可有效的保護豬群免受PCV2的損害。美國富道公司2006年推出了PCV1-PCV2嵌合型滅活疫苗-SuvaxvnoJ.Segal£s使用該疫苗進行免疫實驗發現:三個豬場中，豬場1和3免疫

6、組比非免疫組平均抗體水平高12%,平均H增重分別高出28g/d和16g/d,豬場2和3免疫組比非免疫組攻毒后血液中病毒含量低（p<0.05）"%在國內，哈爾濱獸醫研究所研究員劉長明研制的PCV2滅活疫苗（LG株）為首個上市產品，該疫苗具有安全性好、抗原含量高、抗母源抗體干擾等特點南京農業大學的姜平教授研制的PCV2滅活苗（SH株）,該毒株免疫原性穩定，能夠引起機體產生較強的免疫力，阻礙圓環病毒的入侵和繁殖皿。此兩種疫苗的研制填補了我國圓環病毒疫苗的空缺，同時也引導了國內圓環病毒疫苗的研發。隨后國內的一些疫苗企業分別推出了自己的產品，這地疫苗都在某種程度上為圓環病毒的控制起到了積

7、極作用。1.2減毒活疫苗制備減毒活疫苗有兩種方法可循：傳統的方法為將病原接種在非易感動物或者細胞，通過連續的傳代培養以降低其毒力，另外一種較為新的方法就是通過基因工程手段將強毒力基因進行缺失或者重組，從而得到減毒的病原體。國內外對圓環病毒的弱族苗研究尚不很多oKenaux等網將PCV2接種于PK15細胞并進行連續傳至120代，發現120代的病毒編碼Cap蛋白的基因有兩個位點發生了突變，導致120代體外增殖能力增強但是毒力卻降低。應用此代細胞毒進行免疫學實驗，120代病毒感染的仔豬病毒血癥發生率低于第一代病毒感染的仔豬.表明此毒株訶作為弱毒候選疫苗、類似于FD公司的嵌合型疫苗Tenaux和Bea

8、ch分別構建了嵌合型PCV1-2W4和PCV1-2"。這兩種疫苗遺傳穩定性好，免疫后可誘導產生廣泛的保護性免疫，對實驗動物進行攻毒實驗并對血液中病毒含址進行測定，發現免疫組的病毒載y：明顯比非免疫組低。雖然弱毒疫苗可對動物產生保護，但是目前為止也僅限于實驗研究，要商品化還'需解決毒力返強等問題，因此仍需進一步的探索研究。2基因工程疫苗2.1亞單位疫苗PCV2的ORF2編碼的Cap蛋白是圓環病毒的結'構蛋白，是圓環病毒的主要抗原區域，具有免疫保護性。目前已經商業化的亞單位疫苗為BoehringerIngelheim,Intervet（Merck"Scherin

9、g-Plough（Merck）的PCV2a-Cap疫苗。這兩種疫苗均為將ORF2片段插入到桿狀病毒基因組中，然后將病毒轉染昆蟲細胞并進行培養，收獲培養物進行純化加入佐劑制備成疫苗。Fort等叫應用Intervet的疫苗-Porcilis,盡管免疫組與非免疫組在外觀癥狀，增重等方面沒有顯著差異，但是攻毒后非免疫組于第7天開始出現病毒血癥（病毒載量：100%）,實驗結束時其比例達到55.6%,而免疫組至實驗結束則只有7%（病毒載雖:80.8%）oFachinger等1,71使用BoehringerIngelheim的CircoF'LEX進行免疫實驗，可以顯著的降低組織病變以及病毒的排泄。通

10、過桿狀病毒表達的蛋白自發的形成了病毒粒子，這種病毒粒子不含有PCV2的致病基因，但是保留了PCV2的抗原性，可以引起機體產生較強的免疫反應。但是真核表達得到的病毒粒子疫苗，價格昂貴，這無疑增加了養殖成本。相較于真核表達系統，大腸桿菌表達系統可以大量的表達目的蛋白。浙江大學周繼勇教授網將PCV2的去核定位信號衣殼蛋白（dCap）和谷胱甘肽-s-轉移酶（GST）融合表達得到GST-dCap蛋白，此蛋白可被多克隆血清特異性識別。湖南農業大學余興龍教授將PCV2衣殼蛋白基因3'端396片段堿旌與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）進行融合表達，免疫保護實驗結果顯示對照組小鼠100%感染,而免

11、疫組僅有12.5%感染叫Cap蛋白用原核表達方式，不但具有其核表達方式所得蛋白的免疫保護性，同時表達量較大，而且目前國內還沒有商品化的PCV2亞單位疫苗，因此圓環病毒亞單位疫苗的商品化將會是一個突破性進展。2.2載體疫苗將PCV2編碼Cap蛋白的ORF2基因片段運用分子生物學手段整合于致弱的病毒或者菌株中.以此微生物作為疫苗免疫動物,則可使動物獲得針對PCV2的抗體。華中農業大學教授陳煥春問將PCV2的ORF1和部分ORF2融合進PKVTK、/gE-/UcZ將重組病毒進行動物實驗：在Babl/c小鼠和豬體內，能夠產生顯著的免疫反應，可分別產生PHV的中和抗體以及PCV2特異性淋巴細胞增殖反應。

12、華南農業大學教授羅滿林四將PCV2-ORF2與豬）-1FN連接至腺病毒得到：rAd-ORF2-lFN-）。重組病毒可使小鼠獲得PCV2-ORF2特異性抗體，且在二免后28天可獲得抗體峰值。Kim等口將ORF2連接進博代氏桿萌aroA突變株（BBS）,將BBS-MCP通過滴鼻形式進行免疫ICR小鼠，抗體測定結果顯示免疫組與非免疫組抗體水平差異顯著（P0.05orO.ODo攻毒后檢測腸系膜淋巴結病毒含量，免疫組和非免疫組分別為：12.6±4.5和23.6±5.6。載體形式的疫苗還有藍耳病毒、桿狀病毒、乳酸菌、酵母菌兇冽等,尤其是乳酸菌和酵母菌，可以通過口服的方式進行免疫，激活了

13、粘膜免疫系統，這無疑使圓環病毒疫苗的研究上升了新的臺階。2.3核酸疫苗PCV2有兩種實驗性基因疫苗：一種為將PCV2的基因組直接注射動物機體，第二種為將編碼PCV2Cap蛋白的ORE2連接至真核表達載體中構建出質粒作為免疫原。Fenaux等四將PCV2基因紐直接注射進小鼠和豬的淋巴結和肌肉，可產生和感染性病毒一樣的結果。Blanchard等兇將構建的PORF2質粒免疫豬可獲得保護性免疫反應，Kamstrup和申會剛四用構建的PORF2的質粒免疫小鼠，可刺激小鼠產生PCV2特異性中和抗體。然而申會剛等網將ORF1或者ORF3同PORF2同免疫時，則干擾了其保護性抗體的產生。Aravindaram

14、等運用基因槍注射PORF2/PORF3或者PORF1/PORF2/PORF3卻得到了比較好免疫效果。產生兩種截然不同的結果可能是由于基因疫苗在常規免疫方式下不穩定，因此導致重復性不好。基因槍免疫方式可使基因疫苗產生最大免疫效果,然而這種免疫方式僅限于實驗研究，應用到實踐中尚存在一定的困難。2.4表位疫苗通過噬菌體展示技術將Cap蛋白進行區域性劃分，然后分析其免疫原性。將免疫原性好的區域運用生物合成技術得到多肽，輔以佐劑制備成疫苗是新型疫苗的趨勢。四川農業大學郭萬柱教授以PCV2SC株為模板，擴增ORF2的三個抗原表位基因A、B、C,并分別與細小病毒VP2基因串聯插入到真核表達載體pCI,將構建

15、的質粒轉染MDBK細胞并免疫小鼠，結果顯示三個質粒都具有較強的抗原性,其中以B區域表位最強。商紹彬等30驗證Cap蛋白231-233位氨基酸為其構象表位的主要中和抗體產生位點。本文作者將Cap蛋白劃分為4個不同區域，并將每區域進行2次串聯表達,通過鼠免疫實驗發現，其中區域2可產生最強免疫,而區域4則引起較低的抗體。由此可見，表位疫苗可清晰的認識到主要抗原區域的存在，避免其他區域對于抗原性的影響。然而，由于不同毒株之間Cap蛋白所編碼的氨基酸存在一定的差別,其免疫效果也就存在差異。因此，將不同毒株的主要抗原表位進行串聯表達將是PCV2表位疫苗研究的重點。3總結與展望現在臨床上廣泛使用的商品疫苗有

16、基于Cap蛋白的基因工程亞單位疫苗及滅活疫苗，處于實驗研究階段的PCV2疫苗有表位疫苗、核酸疫苗及新型載體疫苗。根據實驗室及臨床實踐結果表明，現行商品化以及實驗性疫苗雖不能完全阻止圓環病毒的感染和傳播，但是都在某種程度上能夠降低病毒血癥,病毒載量以及病毒的排泄。圓環病毒病主要引起機體的免疫器官功能下降，導致機體的免疫力下調，且當豬群中有其他病原體存在，PCV2的感染可促進這些病原對機體造成更大的損害，再由于圓環病毒在豬群感染的普遍性,免疫豬圓環病毒疫苗對最大程度的降低豬群內的圓環病毒的存在鼠,提高豬群的健康水平，增加養殖效益，具有非常重要的作用。另外，由于近幾年流行的毒株以PCV2h較多，因此

17、加速PCV2b疫苗的研究可能將是以后疫苗研究的重點。參考文獻：1 AlanGM,EllisJA.Porcinecircovirus:areview(J|.JVetDiagnInvest.2000,12(1)：314.2 ClarkEG.Post-weaningmuhisystemicwastingsyndrome(C.27thAnnu.Meet,1997.3 Grau-RomaL,FraileLScgal6sJ.Recentadvancesintheepidemiology,diagnosisandcontrolofdiseasescausedbyporcinecircovirustype2(

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