1、水痘減毒活疫苗的研究進展甘霖I,王明麗'，陳敬賢u1.安徽醫科大學微生物學教研室，合肥230032；2.美國酊倫比亞大學病理與細胞生物學教研室，紐約10032摘要:水痘是由水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)引起的種高傳染性疾病。接種疫苗是預防和控制VZV流行的最有效手段。美國從1995年開始實施兒童接種水痘疫苗的政策，顯著降低r水痘相關疾病的發病率和病死率。近年來，水痘疫苗在我國應用越來越廣泛。本文就水痘減毒活疫苗Oka株的研發，疫苗的有效性、安全性,病毒減毒的分子生物學特征和免疫策略等方面進行綜述，以期能更全面地認識水痘減毒疫苗在預防和控制VZV傳播方面所起的作用。關鍵詞:水痘帶狀皰疹病毒

2、;Oka疫苗株；水痘疫苗ProgressinvaricellavaccineresearchGANLin1,WANGMing-Li1,JasonChen1,2I.DepartmentofMicrobiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2.DepartmentofPathologyandCellBiology,ColumbiaUniversityNY10032,USAAbstract:Varicellaisahighlycontagiousdiseasecausedbyvaricella-zostervirus(VZV).Vaccina

3、tionhasprovidedthebestmeanstocontrolinfection.Anumberofcountriesmaintainauniversalchildhoodvaccinationpolicysince1995,resultinginadramaticdecreaseintheincidence,morbidityandmortalityrelatedtovaricella.Inthisarticle,wereviewthedevelopmentofvaricellaOkavaccine,theresearchinvaccineefficiencyandsafety,t

4、hemolecularmechanismofattenuation,aswellasnewideasinimmunizationstrategy,summarizingthecurrentadvancesandlimitsofthevaricellavaccinesinceitsworldwideapplication.Keywords:Varicella-zostervirus;Okastrains；Varicellavaccine水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)屬皰疹病毒a亞科,為雙鏈DNA病毒，其原發感染為水痘，潛伏感染再激活時可引發帶狀皰疹。水痘

5、通常表現為輕癥自限性疾病，伴有特征性皮膚皰疹,偶爾會出現嚴重的并發癥，包括細菌繼發感染、敗血癥性休克、肺炎和腦炎，病死率較高。成人發生水痘雖然比較少見，但出現嚴重并發癥的概率明顯增加。嚴至的并發癥在免疫缺陷患者中更常見，免疫缺陷兒童中有50%的水痘患兒會發生并發癥。帶狀皰疹是體內潛伏的VZV被激活所致，多發生于成人、老人和免疫缺陷的個體，臨床表現主要是神經痛及沿周圍神經分布的水皰樣皮疹,隨著年齡增大，帶狀皰疹所致的神經痛癥狀越為明顯，持續時間更長。基金項目：國家自然科學基金(30872253)；安徽省科技攻關計劃(08010302179)通信作者：陳敬賢，E-niail：jc28Columbi

6、a,eduCorrespondingauthor：JasonChen,E-mail:jc28C世界衛生組織(WorldHealthOrganization,WHO)建議水痘疾病相對嚴重的國家普及疫苗接種。日本和美國分別于1987年、1995年開始推行給易感兒童接種疫苗。迄今VZV減毒疫苗株v-Oka已在日本、美國、韓國、中國和歐洲許多國家相繼被用于預防水痘。本文就水痘Oka疫苗的研發，疫苗的安全性、有效性，病毒減毒的可能分子機制和有關免疫策略的新思路等進行綜述，以期能更全面地認識水痘減毒疫苗在預防和控制VZV傳播方面所起的作用。1水痘疫苗的有效性研究1974年日本學者Ta

7、kahashi等從1名典型的水痘患兒水皰液中分離得到Oka疫苗株的親本(pOka)，后經在豚鼠胚胎成纖維細胞和人成纖維細胞株(WI-38,MRC-5)多次傳代后,獲得了VZV減毒疫苗株v-Okao疫苗首先在健康的兒童志愿者中進行試驗，結果顯示，疫苗不僅具有良好的安全性和免疫原性，而且有助于防止水痘在易感兒童之間傳播。對接種該疫苗的兒童所進行的長期抗體水平檢測顯示，兩年以后98%兒童的血清VZV抗體仍保持陽性,初步說明疫苗具有長期的保護作用。在臨床早期的有效性研究中，美國采用了隨機、雙肓、設置安慰劑對照的方法，在健康兒童中檢測1次接種Oka疫苗（Merck公司）后第1年的有效率,結果為100%”

8、。隨后芬蘭采用相同的方法進行研究'顯示Oka疫苗（GlaxoSmithKline公司）的有效率90%。水痘疫苗上市并廣泛應用后，美國曾在加利福尼亞、得克薩斯和賓夕法尼亞3個州監測疫苗使用后的水痘發病情況。數據顯示，在此期間這3個州水痘發病率下降近80%，與水痘相關的住院率下降88%,水痘引起的病死率下降66%,而且減毒活疫留的使用沒有增加帶狀皰疹的發病率。澳大利亞從1999年開始使用Oka疫苗，結果14歲兒童中水痘相關的住院病例呈逐年下降趨勢5。所有這些資料都顯示水痘疫苗在降低VZV所致疾病的發病率和病死率方面十分有效。另一項研究為通過檢索19952（X）6年PubMed中關于水痘疫苗

9、有效性的報道來總結疫苗的免疫效果。研究者根據報道中水痘患者皮膚皰疹的數量以及是否存在并發癥等將病例分為輕微（皮疹50個）、中等（皮疹50-500個）、嚴重（皮疹500個或存在嚴重并發癥）。結果顯示，水痘疫苗對所有類型水痘的總預防效果為44%-100%,預防中等與嚴重之間水痘的效果為86%100%,預防嚴重水痘的效果是100%。總之，根據10多年來世界上多個國家的實踐經驗,v.Oka疫苗的預防效果是值得充分肯定的。2水痘疫苗減毒機制的研究NCR:nonccMlingregion；ORFreadingframe(GomiY,etal.,2002.圖1v-Oka與p-Oka基因組之間的核昔酸差異Fi

10、g1.MutationsbetweentheOkavaccinevirus(v-Oka)andtheparentvirus(p-Oka)隨著分子生物學技術的不斷發展，人們開始從分子水平研究v.Oka水痘減毒活疫苗的減毒機制。首先，通過比較減毒后的v-（）ka與減毒前的親本pOka的全基因序列來了解它們在分子水平上的差別。對病毒基因組的多個部分用聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）擴增，然后克隆PCR產物或直接對PCR產物測序。比較v-Oka與p-Oka的全基因序列，發現兩者之間只有42個堿基發生了改變。DNA序列分析認為，其中有20個堿基改變導致了氨基酸發生轉

11、換，有17個是沉默突變，另外5個發生在非編碼區。令人驚訝的是，在42個堿基改變的位點中有15個落在開放讀碼框架（openreadingframe,ORE）62中，其中包括8個氨基酸置換，提示ORF62的基因突變可能與p.Oka的減毒有重要關系。ORF62（以及它的重復拷貝ORF71）編碼立刻早期蛋白IE62JE62是VZV的主要轉錄激活因子，直接參與病毒復制。除了IE62以外，其他12個氨基酸發生置換的位點分別位于ORF6、9A、10、21、31、39、50、52、55（1）.55（2）、59和64（圖1）。核酸序列研究發現，v.Oka是由不同的病毒株組成的混合體。有研究者通過空斑純化方法從V

12、-Oka疫苗獲得13個不同的分離株。對它們的ORF62序列進行分析，發現有的株囊括了所有與pOka不同的8個氨基酸(如S70株)，最少的也有5個氨基酸改變(如S7-13株)。為了研究這些不同氨基酸的改變對病毒生物學性狀的影響，通過比較S7-01、S7.13、v.Oka和p-()ka在人胚肺成纖維細胞中形成的空斑大小，發現P-Oka形成的空斑最大，依次為S713、vOka、S7Ql。進一步利用感染性中心試驗(infectiouscenterassay)來計數病毒感染的細胞數量，結果顯示pOka感染細胞的數量是v-Oka的2.1倍，是S7-13的2.6倍，是S7Q1的4.2倍。以上結果提示,不同的

13、v-Oka克隆之間在病毒復制效率方面存在一定差異，p-()ka株的復制效率高于vOkao因此,IE62中氨基酸的改變可能導致病毒復制效率以及病毒在細胞之間的傳播能力下降。對臨床分離的VZV病毒株的ORF62序列進行分析,發現所有的臨床分離株都與P-Oka一樣，在ORF62均有15個堿基位點與v-Oka不同口。因此ORF62的變化很可能是p-Oka發生減毒作用的主要分子機制。ORF62中這些單一核昔酸的變化還導致一些酶切位點的改變，如BssH",NaeI和SmaIo分析ORF62中的SgI酶切位點的改變能區分V.Oka疫苗株與VZV野生型毒株口°。為了更有效地研究v.Oka的

14、減毒機制，有研究者用細菌人工染色體技術(bacterialartificialchromosome,BAC)克隆(p-Oka的全基因組p-OkaBAC可以在大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)DH10B中穩定增殖，從E.coli中提取的DNA轉染人胚肺成纖維細胞后可觀察到典型的細胞病變，并可傳播給鄰近的細胞。P-OkaBAC使得研究v-Oka減毒作用的分子機制變得更為簡便。3水痘疫苗的安全性研究Merck公司制造的v-Oka水痘減毒活疫苗Varivax于1995年被批準上市，現已應用于世界上46個國家。多個國家的學者對疫苗的免疫效果和安全性做了更多、更全面的研究。Merc

15、k公司本身貝。通過SpontaneousPostmarketingAdverseExperience和VaricellaZosterVirusIdentificationProgram(VZVIP)途徑來獲取疫苗安全性方面的信息。前者是Merck公司從世界各地收集與應用有關Varivax不良反應的信息反饋系統，情報資料來自醫護人員和疫苗接種者及家屬的主動報告和醫學文獻中相關案例的收集，所收集的不良反應主要包括突破感染(breakthrough)和二次傳播(secondarytransmission)等。突破感染是指接種疫苗者在42d后患上水痘(42d以內出現皮疹可能由疫苗所致)，說明疫苗在這些

16、個體中沒有起到應有的保護作用。二次傳播是指接種疫苗者發生感染以后將疫苗病毒傳播給了未接種疫苗的個體，導致后者發生了由v-Oka疫苗株引起的感染。Merck公司在19952005年的10年間共向全世界銷售了55700000人份的Varivax,一共收到了16683例不良反應報告。VZV毒株分型(VZVidentificationprogram,VZVIP)是利用PCR結合限制性內切酶酶切的方法,將水痘病人的VZV區分為野生型毒株或疫苗株的一項研究課題。臨床標本取自下列疫苗接種者:42d內出現50個水皰疹、突破感染、帶狀皰疹，伴有并發癥以及疑似為二次感染的患者，分型工作由紐約哥倫比亞大學附屬兒童醫

17、院完成。各類不良反應的統計結果如下:接種疫苗后42d內出疹:一共有3192例報告接種疫苗后42d內出現皮疹，其中水痘樣皮疹占51%,65%發生在接種后14d內。經VZVIP研究發現，由野生型VZV引起的皮疹發生較早，疫苗接種后2周內出現皮疹的84%是由野生型VZV引起的；而疫苗株引起的出疹發生較遲,36周出現皮疹的83%是由v-Oka株所致。突破感染：關于突破感染的報道有5054例，發生率為0.9/10萬。其中大約1%的患者屬于病情較為嚴重(皮疹50個)。在所有突破感染的病例中，經檢測均未發現v.Oka疫苗株VZVO帶狀皰疹:接種疫苗后發生帶狀皰疹的報道共有697例，患者的年齡在13個月和68

18、歲之間，中位數為3.4歲。用PCR分型技術對其中的95例進行了病毒分型，由v-Oka疫苗株引起的為57例，野生型VZV引起的有38例。進一步分析表明，帶狀皰疹出現的位置與疫苗接種的位置高度相關。神經系統的不良反應:用PCR分析接種疫苗后出現神經系統不良反應的30例患者的腦脊液，發現僅有2例存在VZVDNA,其中1例為野生型VZV,而另1例未能確定基因型。二次傳播:通過VZVIP確認的二次傳播有3例,其中1例是30歲孕婦，她的1歲男孩在接種疫苗后的第24天出現約30個皮疹，此后的第16天，母親出現水痘。另1例為4個月男嬰，19d前他不到2歲的哥哥在接種疫苗2周后出現25個皮疹°還有1例

19、為35歲的父親感染了水痘，他的1歲男孩在接種疫苗17d后出現12個皮疹。所有3例病人都與家庭中的疫苗接種者有過密切的接觸。播散性感染:在所有的疫苗接種者中，共有7例播散性的VZV感染被確認是由V-Oka引起的，其中6例為免疫缺陷病患者，另1例為唐氏綜合征病人。10年的監測研究顯示，v.Oka疫苗(Varivax)的使用顯著降低了水痘相關的住院率、病死率和醫療費用。大多數不良反應都不嚴重：2/3的報告病例表現為發熱、出疹或者注射部位反應;諸如腦膜炎這樣的嚴重并發癥極為少見，旦主要發生在細胞免疫損傷的患者中。目前看來,v-()ka疫苗具有普遍的耐受性和良好的安全性，但繼續監測它的安全性是很必要的。

20、4免疫策略的探討最近有研究顯示在接受水痘疫苗免疫接種的兒童中水痘的發病率有上升趨勢，但是這些突破感染大多未引起嚴重的臨床癥狀。因此，研究者開始關注如何更加有效地使用水痘疫苗。哥倫比亞大學的Gershon教授認為，以前檢測血清中VZV抗體含量的方法可能不夠準確，所檢出的抗體中包括了許多對感染不起保護作用的抗體，因而對疫苗的免疫效果估計偏高。使用能夠更好地反映保護性抗體的膜免疫熒光抗體方法(fluorescentantibodytomembraneantigen,FAMA)，檢測一次免疫接種后兒童血清陽性率只有76%,6，因此有必要增加免疫接種的劑量。已有報道顯示增加接種劑量是安全的，并可顯著增強

21、免疫應答。以VZV病毒糖蛋白為抗原的酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測VZV抗體，顯示二次接種麻疹-風疹-腮腺炎水痘四聯疫苗比一次接種的陽性率從89%上升到99%，血清中抗體的幾何平均效價從13.0u/ml上升到588u/ml171o而同時其他3種病毒(麻疹風疹-腮腺炎)的相應抗體效價并未明顯提高，提示VZV病毒與其他病毒不同，一次免疫所產生的免疫反應不夠完全。另一項長達10年以上的研究發現,二次免疫比一次免疫受體發生突破感染的概率要低。所以初次接種水痘疫苗以后，在適當的時候再加強免疫1次，將會獲得更好的預防效果。另外，疫苗的覆蓋

22、率對疫苗的預防效果也有影響。日本從1987年開始推薦在12個月的易感人群中應用水痘疫苗，但是并沒有列入計劃免疫接種的范圍，1987-2005年疫苗接種的覆蓋率只從6.8%增長至32.1%,水痘的流行病學特征和自然感染率并沒有發生明顯改變3】。如果能將水痘疫苗列入計劃免疫范圍，將大大增加水痘疫苗的免疫接種覆蓋率。在此基礎上，再實施加強免疫1次來保持疫苗接受者抵抗野生型VZV感染的能力，將可能逐步減少野生型VZV的感染率，最終消滅野生型vzvo5展望皰疹病毒感染十分普遍，即使痊愈，大多還會伴終身潛伏感染。皰疹病毒相關疫苗的制備困難較大，進展緩慢。VZV減毒活疫苗是迄今第I個也是唯一得到國際上廣泛應

23、用的皰疹病毒疫苗。V-Oka株水痘疫苗在預防水痘方面所起的功效非常顯著。然而，疫苗的使用方法還需要優化。目前所遇到的最主要問題包括突破感染常有發生，有少部分兒童對1個劑量的水痘疫苗不產生免疫反應，以及1次免疫往往不能提供足夠的免疫刺激來產生長效的記憶性T細胞。因此，不僅要大力推廣水痘疫苗的接種范圍，還需要加強疫苗應用后的相關研究,才能使人們更好地認識和使用水痘疫苗，并可能拓展它的使用范圍。參考文獻|1JAsanoY,TakahashiM.Clinicalandserologictestingofalivevaricellavaccineandtwo-yearfollow-upforimmuni

24、tyofthevaccinatedchildrenJ.Pediatrics,1977；60(6)：810-8142WeibelR,NeffBJ,KuterBJ,elal.Liveattenuatedvaricellavirusvaccine:efficacytrialinhealthychildrenJ.NEnglJMedJ984；310(22):1409-14153VarisT,VesikariT.EfficacyofhightiterliveattenuatedvaricellavaccineinhealthyyoungchildrenJJ.JInfectDis,1996,174(Supp

25、l3):S330-S334_4JReynoldsMA,ChavesSS,HarpazRal.TheimpactofthevaricellavaccinationprogramonherpeszosterepidemiologyintheUnitedStates:AreviewJ.JInfectDis,2008；197(Suppl2):S224-S2275 MacartneyKK,BurgessMA.VaricellavaccinationinAustraliaandNewZealandJ.JInfectDis,2(X)8,197(Suppl2)：S191-S195SewardJF,MarinM

26、,VdzquezM.VaricellavaccineeffectivenessintheUSvaccinationprogram:AreviewJ.JInfectDis,2008,197(Suppl2):S82-S896 GomiY,SunamachiH,MoriY,elaLComparisonofthecompleteDNAsequencesoftheOkavaricellavaccineanditsparentalvirusfJ.JVirol,2002,76(5):11447-11459GomiY,ImagawaT,TakahashiMal.ComparisonofDNAsequencea

27、ndtransactivationactivityofopenreadingframe62ofOkavaricellavaccineanditsparentalvirusesJ.ArchVin)lSuppl,2(X)1,(17)：49-567 YamanishiK.MolecularanalysisoftheOkavaccinestrainofvaricella-zostervirusLJ.JInfectDis,2008,197(Suppl2)：S45-S4810LoparevVN,ArgawT,KrausePR,etal.Improvedidentificationanddifferenti

28、ationofvaricella-zostervirus(VZV)wild-typestrainsandanattenuatedvaricellavaccinestrainusingaVZVopenreadingframe62-basedPCRJ.JClinMicrobiol,2000,38(9):3156-316011JNagaikeK,MoriY,GomiY,etaLCloningofthevaricella-zostervirusgenomeasaninfectiousbacterialartificialchromosomeinEscherichiacollJj.Vaccine,200

29、4,22(29-30):4069-4074121ChavesSS,HaberP,WaltonK,eeaLSafetyofvaricellavaccineafterlicensureintheUnitedStates:Experiencefromreportstothevaccineadverseeventreportingsystem,1995-2005J.JInfectDis,2008,197(Suppl2):S170-S17713JGaleaSA,SweetA,BeningerP9etal.Thesafetyprofileofvaricellavaccine:a10yearreviewJ.JInfectDis,2008,197(Suppl2)：S165-S16914LeungJ,RueA,LopezA,etal.Varicellaoutbreakreporting,response,management,andnationalsurveillanceJ.JInfectDis,2008,197(Suppl2):S108-S11315GershonAA,KatzSLPerspectiveonlivevaricellavaccineJJ.JInfectDis,20