1、必述摘杵"綜文水產口服疫苗研究進展黃鈞I,施金谷"，陳明二黃艷華I（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530005；2.廣西壯族自治區水產研究所，廣西南寧530021）中圖分類號：S942.5文獻標識碼：B每年全球對魚產品的消費最約為12億噸，從1980年開始，水產養殖業為全球漁業產業提供的水產品以每十年兩倍的速度增長，并且有不斷上升趨勢。為了滿足不斷增長的水產品需求，集約化養殖業迅猛發展，隨之帶來的是養殖環境不斷惡化、病害頻發肆虐、病原耐藥性增強、藥物殘留等制約水產養殖業健康發展和危害消費者健康等諸多問題。因此，水產養殖行業急需一種及時有效、可持續發展、經濟適用的疾病

2、防治方法。1942年，隨著Duff首次將殺鯉氣單胞菌（Aeromonas.Salmonici-da）的滅活口服疫苗應用于硬頭鱷并獲得成功后，意味著一種新的魚病防治方式開啟。隨后，國內外不少學者對疫苗在魚類中的應用進行了大最的研究開發，特別是近年來，隨著對魚類腸道粘膜免疫系統機制研究的不斷深入，抗原載體的不斷研發，抗原包裹技術的不斷完善,魚類口服疫苗研究取得了一定進展。本文僅對水產口服疫苗的研究進展做一綜述。1魚類腸道免疫機理11魚類腸道粘膜免疫的細胞及應答魚類的腸道主要包含固有層和上皮層，巨噬細胞、粒細胞、嗜堿性粒細胞等白細胞主要分布在固有層，上皮層中則較為少見，但鯉魚腸道上皮層中分布有大量T

3、淋巴細胞（Ig-）,固有層中為B淋巴細胞（I廠）。在舌齒鱗腸道中，1廠密度大于Ig',且主要存在于腸上皮中，越是靠近肛門，淋巴細胞的數量就越多，表明魚類的后腸具有更高的免疫相關性。Companjen也證實了魚類后腸為抗原的主要吸收和加工的部位，抗原可在后腸被巨噬細胞吞噬，誘導產生免疫應答。一般認為，可溶性抗原較顆粒性抗原更容易被吸收，相應地也更容易被降解，運用包裹技術制成的可溶性微囊可減基金項目：廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科攻1123006-4）。文章編號：1002-5235（2013）01-0055-03緩抗原的降解，持續性釋放抗原，從而引起更強的免疫應答。通常認為，口服疫苗

4、引起的免疫反應主要是以粘膜免疫為主，它對魚類疾病的防御起到決定性作用，但對于魚類粘液免疫運轉機制目前尚未清楚。魚類雖然缺乏如哺乳動物淋巴集結（Peyer節）等的腸道相關淋巴組織（GALT）,但卻具有大量的淋巴細胞。抗原在進入腸道后，小分子或可溶性物質經細胞間隙滲透進入血液，大分子顆粒則被巨噬細胞吞噬后呈遞給相關淋巴組織，從而引起機體進一步的免疫反應。鯉魚的腸細胞與哺乳動物中GALT的M細胞類似，能將抗原從腸道上皮轉移到淋巴聚集部位，通過胞飲和內吞作用,將抗原呈遞到巨噬細胞和外周組織中。大分子蛋白或細菌抗原則主要經后腸上皮細胞吞飲吸收。有研究證明，前腸及后腸等組織的粘膜具有能夠獨立完成免疫應答的

5、細胞基礎，口服免疫不僅能引起粘膜免疫，還能引起系統免疫，口服免疫滅活的食果糖乳桿菌可使黑躺腸道內I”淋巴細胞數量和游走于身體各部位的嗜酸性顆粒細胞（EGC）數量顯著增加U0-,21o表明口服免疫不僅能夠誘導抗體介導的免疫應答,還能夠誘導包括細胞免疫在內的全身性免疫反應。12魚類腸道免疫分子哺乳動物主要組織相容性復合體（MHC）是外源性抗原呈遞的主要物質。在很多真骨魚類中也能克隆到大量MHC-2的cDNA,同時MHC-2的mRNA可在大西洋錐鯉中大量表達，免疫后魚類的MHCmRNA表達量顯著增加方。表明MHC分子在魚類粘膜免疫中對抗原的呈遞起著重要的作用。另外，感染絳蟲后的褐第腸道中的血清素、P

6、物質（SP）、腸血管肽（VIP）等水平均呈不同程度的上升，證明這些免疫調節因子參與了魚類的腸道免疫調節3、可見一些調節因子對魚類的粘膜免疫也起到一定作用,但其調節機制還知之甚少。2目前幾種較為成功的口服疫苗2.1微囊或包裹疫苗目前已報道的包裹材料主要有海藻酸鈉、殼聚糖和脂質體。以海藻酸鈉包裹溶藻弧菌后免疫鯉魚和虹第，試驗組具有更高的抗體效價，同時粘膜上的漿細胞數量大幅增加。用其包裹嗜水氣單胞菌制成微囊對銀鯽進行口服免疫后，血清和后腸粘膜抗體效價可高達1：80和1：320皈；將一種表達半乳糖昔酶的DNA疫苗包裹于殼聚糖中免疫羅非魚，在其腮、胃、脾臟中均檢測到半乳糖昔酶3);將載有淋巴囊腫病毒的核

7、酸疫苗包裹于殼聚糖中制成殼聚糖微囊核酸疫苗免疫牙鮮，該微囊疫苗被腸道吸收后能持續釋放抗原長達45d,在牙鮮各組織中均能檢測到包含淋巴囊腫病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因的mRNA,在組織切片中同時也發現病毒蛋白表達，血清中抗體的濃度大幅度增加，免疫效應為陽性用脂質體包裹殺氣單胞菌制成微囊免疫鯉魚，發現其血清、腸道粘液、膽汁中的抗體水平明顯增高,感染后的存活率達到83.5%3)。2.2生物載體疫苗于俊紅等將生物包埋技術和化學包埋技術相結合，讓鹵蟲分別攜帶全菌疫苗和微囊疫苗，同時設計了微囊疫苗組和全菌疫苗組，喂食免疫虢魚，攻毒后，攜帶微囊疫苗的鹵蟲組免疫保護率最高，達73.17%；其次為微囊疫苗組，

8、為56.18%,最低為攜帶全菌疫苗組，為36.18%(20oLin等)則通過生物包埋和重組蛋白技術相結合，運用基因重組技術制備口服疫苗，以鹵蟲無節幼體為生物載體對魚類進行免疫，在石斑魚中運用，存活率可由30%提高到82%。轉基因口服疫苗在獸用疫苗中已獲得了較大進展。目前已成功構建了將草魚呼腸孤病毒VP6、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、綠色熒光蛋白(GFP)融合表達的植物載體pCAMBIA1302-LTB-VP6")o將LTB和一種病毒多肽或者GFP融合后在馬鈴薯莖塊中獲得表達，用該植物疫苗免疫鯉魚，發現鯉魚對LTB的吸收增加,并能引起特異性免疫反應習O2.3其他口服疫苗龔輝

9、等刃構建了攜帶嗜水氣單胞菌溶血素基因的重組菌，該菌能夠表達嗜水氣單胞菌溶血素，利用其胞外產物制成的免疫刺激復合物，經口服免疫，發現鰻穌淋巴細胞的增殖轉化能力顯著提高，并能誘導免疫保護和免疫記憶，一免的保護率為44.4%,二免后其保護率可達100%e此外，魚類寄生蟲的口服疫苗也逐漸被人們關注和研究。3面臨問題和發展趨勢水產口服疫苗現在所面臨的最大問題是抗原的保護問題，核心是如何使抗原在載體和水體中具有較好的穩定性和如何在魚體內保持抗原的完整性。因此選擇合適的抗原處理方式、合理的有效劑景、適當的免疫時間、免疫程序和免疫次數等都是口服疫苗研究中亟待解決的問題。盡管目前注射型疫苗在疫苗市場中仍占主要位

10、置，但因其在使用過程中勞動強度大、容易造成動物受傷引起感染甚至死亡等不利因素的存在，研發具有低刺激性、高敏感性、使用簡便和低成本的口服疫苗是未來魚用疫苗發展的趨勢。參考文獻1NelsonMcmillan.D,Secombes.ChristohcrJ.Isolationofrainbowtrout(Oncorhynchusmykiss)intestinalintraepitheliallymphocytes(TEL)andmeasurementoftheircytotoxicactivityJ.Fish&ShellfishImmunology,1997,7(8)：527-541.2 Ro

11、mbout.JHWM,Taveme-Thielc.AJ,Villcna.MI.Thegut-associatedlymphoidtissue(GALT)ofcarp(Cypri-nuscarpioL.)J.DevCompImmunol,1993,7(1)：55-66.3 Abelli.L,Picchietti.S,Romano.N,etal.Immu*no2histochemistryofgutassociatedlymphoidtissueoftheseabassDicentrarchuslabrax(L.)J.FishShellHshImmunol,1997,7(4)：235-245.4

12、Companjen.A.R,Florack.D.E,Bastiaans.J.H,etal.Developmentofacost-effectiveoralvaccinationmethoda-gainstviraldiseaseinCshJ.DevBiol(Basel),2005,121：143-150.5 Joosten.P.H.M,T5emersma.E,Threels.A,etal.OralvaccinationoffishagainstVibrioanguillarumusingalginatemicroparticlesJ.FishShellfishImmunol,1997,7(7)

13、：471-485.6 鞏華，吳淑勤,潘厚軍.硬骨魚類粘膜免疫機理研究概況J.動物醫學進展,2006,27(6)：24-28.7 李新華，沈錦玉,潘曉藝，等.魚類口服疫苗的研究進展J.水產科學,2010,29(1)：51-55.8Stand.H.K,Dalmo.R.A.AbsorptionofimmunomodualatingpC1,3)-glucaninyolksaclarvaeofAtlantichalibut,Hippoglossushippoglossus(L.)J.Jour-nalofFiahDisease,1997,20(1)：41-47.9 01afsen.J.A,Hanaen.D

14、G.H.IntactantigenuptakeinintestinalepithelialcellsofmarinefishlarvacJ.JournalofFishBiology,1992,40(2)：141-156.10 羅曉春，李安興,謝民權，等.斜帶石斑魚黏膜免疫系統結構的研究JL水生生物學報,2005,29(2)：19-32.(11Quentel.C.VigncuDe.M.AntigenuptakeandimmuneresponsesafteroralvaccinationJ.DevBiolStand,1997,90：69-78.12 SimonaPicchietti,Massimo

15、Mazzini,AnnaRitaTaddei,etal.EffectsofadministrationofprobioticstrainsonGALToflarvalgiltheadseabream:ImmunohistochemicalandultrastiucturalstudiesJ.Fish&ShellfishImmunology,2007,22(1-2)：57-67.13 PressC.M.HieMorphologyoftheimmunesysterainteleostfishesJ.Fish&Shellfishlmmunology,1999,9(4)：309-318

16、.14 Koppang.E.0,Lundin.M.DifleringlevelsofMhcclassIIachainexpressioninarangeoftissuesfromvaccinatedandnon-vaccinatedAtlanticsalmon(SalmosalarL)J.Fish&ShellfishImmunology,1998,8(3)：183-196.15 DezfuJi.B.S,Arrighi.S,Domeneghini.C,etal.Inununo-histochemicaldetectionofneuromodulatoraintheintestineofS

17、almotruttaL.naturallyinfectedwithCyathocephalustruncatusPallas(Cestoda)j.FishDis,2000,23(4):265-273.16 李新華，沈錦玉，尹文林等.銀鯽口服嗜水氣單胞菌疫苗的免疫和免疫組化研究J.水生生物學報,2007,31(1):125-130.17 Ramos.ErwinA,Relucio.JenneLizaV,etal.GeneEx-pressioninTilapiaFollowingOralDeliveryofChitosan-EncapsulatedPlasmidDNAIncorporatedinto

18、FishFeedsJ.MarineBiotechnology,2005,7(2)：89-94.18 JiyuanTian,JuanYu.XiuqinSun.ChitosanmicrospheresascandidateplasmidvaccinecarrierfororalimmunisationofJapaneseflounder(Paralichthysolivaceus)J.VeterinaryImmunologyandImmunopathology,2008,126(34)：220-229.19 TakuyaIrie.ShinobuWatarai.etal.Protectionagai

19、nstexperimentalAeromonassalmonicidainfectionincarpbyoralimmunisationwithbacterialantigenentrappedliposomesJ.Fish&ShellfishImmunology,2005,18(3)：235-242.2005,18(3)：23524220余俊紅，紀偉尚，徐懷恕.笄魚口服生物膠囊疫苗的研究J.高技術通訊,2001,3：15-18.21 Lin.J.H,Yu.C.C,etal.AnoraldeliverysystemforrecombinantsubunitvaccinetofishJ.DevBiol,2005,121:175-180.22 周勇，曾令兵,范玉頂，等草魚呼腸病毒VP6蛋白和大腸桿菌LTB亞單位植物融合表達載體的構建J.中國水產科學,2011,18(1):1-7.23 CompanjenA.R,FlorackD.E.A,etal.Improveduptake