1、Vol.32,No.2296305文章編號：0254-5357(2013)02-0296-10氨氮污染源區包氣帶剖面微生物生態分布特征的研究程雅楠口，關翔宇'，曲文龍3,陳鴻漢，劉菲），謝宇軒'，朱玲玲'（1.水資源與環境工程北京市重點實驗室，中國地質大學（北京），北京100083；2.中交鐵道勘察設計院有限公司，北京100088；3.沈陽水務集團，遼寧沈陽110003）摘要：包氣帶土壤中氨氮污染遷移規律已成為近年來國內外學者研究的重點，目前在氨氮污染遷移規律研完中采用柱實驗模擬以及軟件模擬的方法較多，土壤生物技術則廣泛應用于污染物降解領域，而在污染物遷移規律研完中應用

2、較少。本文采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術、16SrRNA序列分析技術以及典范時應分析相結合,對華北平原3個典型氨氮污染區土壤表層至包氣帶剖面微環境的細菌垂直分布特征及群落結構進行研究。結合污染區土壤理化性質分析，認為包氣帶上壤剖面的細菌群落中存在著與氮循環、硫酸鹽代謝等過程偶聯的優勢細菌類群，說明土壤微環境中細菌群落分布明顯受氨態氮、硝態氮、亞硝態氮和硫酸鹽的分布影響，進一步表明污染土壤優勢茵群的群落結構信息是描述包氣帶土壤環境氨氮污染物遷移規律的重要參數。關鍵詞：包氣帶；氨氮污染；微生物群落；變性梯度凝膠電泳；l6SrR、A中圖分類號：S151.93；X820.4文獻標識碼：A包氣帶作

3、為全球生物地球化學循環的重要地質介質，對地下水生態系統影響顯著，其理化因素的空間特異性能夠使相應上壤環境中微生物群落發生改變，進而影響氨氮污染物在包氣帶土壤生態系統中的運移，以及氨氮污染降解菌的分布。近年來，現有的物理化學技術對處理大面積的土體和地下水污染已不具優勢，污染土壤生態環境的研究重點已開始轉向分子生物修復領域.采用PVA1799冷凍改良技術固定的優勢菌群，能夠使濃度為565mg/L的苯酚去除率達到94%以上。在硝化性能明顯的氮污染土壤中分離得到的一種微生物Bacillussp.LY能夠在有機物去除的同時,將氨氮轉化為氮氣，并能以多種有機污染物包括壬基酚聚氧乙烯醮（NPEOs）、鄰苯二

4、酚及苯酚等為唯一碳源生長，是新型高效生物脫氮聯合去除有機污染物技術的重要突破電。土壤環境中分離出具有特殊作用的微生物，一株鑒定為OchrobactrumintermediumDN2的煙堿降解細菌經證實，能夠去除或減少煙草廢棄物中煙堿”。在苯乙酸廢水污染的高鹽土壤分離出的中度嗜鹽菌Halomotuissp.BYS-1中分離提取的耐鹽基因片段，為耐鹽遺傳機制的研究提供了高質雖實驗材料，在鹽污染土壤治理中得到有效利用們。收稿日期：2012-03-07；接受日期：2012-07-24基金項目：國家自然科學基金項目面上基金（51078338）；中央高校基本科研業務費自由探索項目（2010ZY05）作者簡

5、介：程雅楠.碩士研究生.從事地卜水及土壤污染微生物修復技術研究。E-mail：ptinny_5696163.conu,通訊作者：陳鴻漢，教授，主要從事地下水科學與環境工程教學與科研工作。E-mail：ehenhonghaneugb.«lu.en0反滲透等物理方法以及化學還原脫氮法是去除包氣帶土壤氨氮污染的傳統方法。但是，這些方法并非完全將硝酸鹽降解為無毒的氣態貌化合物和氮氣，僅為硝酸鹽的轉移，還會產生二次污染問題。近年來，生物脫覦技術尤其是分子生物技術在土壤氨氮污染去除中逐漸得到關注。變性梯度凝膠電泳（簡稱DGGE）技術能夠直接利用DNA及DNA對微生物遺傳特性進行表征，不但避免r耗

6、時的傳統菌種分離，更可鑒定出無法利用傳統方法分離的萌種，它的分辨精度相比瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳更加精確，可以檢測到一個核甘酸水平的差異。DGGE膠體圖譜中出現的可見條帶，分別代表土壤樣品中優勢細菌16SrRNA的目的片段，條帶的數鼠反映出細菌群落組成中的優勢群體的數量，條帶的強度代表細菌種群中細菌的含量，與模板25.StefanJG,OrnP,ThomasMG.Denitrifyingbacteriaisolatedfromterrestrialsubsurfacesedimentsexposedtomixed-wastecontamination_J_.AppliedatulEn

7、viron-menlalMicrobiology,2010(76):3244-3254.26ChristianeW,AndreaT,AntjeW.Horizon-specificbacterialcommunitycompositionofgennangrasslandsoils,asrevealedbypyrose(,uencing-basedanalysisofI6SrRNAgenesJ.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2010(76):6751-6759.MicrobialEcologicalDiversityCharacteristicsofth

8、eSoilProfileintheVadoseZonePollutedbyAmmoniaNitrogenCHENGYa-nan1'2,GUANXiang-yu1,QUWen-long3,CHENIlong-han*,LIUFei,XIEYu-xuan,ZHULing-ling(1.BeijingKeyLaboratoryofWaterResourcesandEnvironmentalEngineering,ChinaUniversityofGeosciences(Beijing),Beijing100083,China；2. RailwaySurveyandDesignInstitut

9、eofChinaCommunicationsCo.,LTD,Beijing100088,China；3. ShenyangWaterGroupCo.LTD,Shenyang110003,China)Abstract:Scholarsathomeandabroadinrecentyearshavefocusedonresearchingammonianitrogenpollutionmigrationrulesinthevadosezonesoil.Columnsimulationandsoftwaresimulationwereprimarilyconductedforthestudyofam

10、monianitrogenpollutionmigration.Biotechnologywaswidelyusedindegradationofpollutantinsoil,butlessappliedtothestudyofpollutionmigration.ThisstudyappliedDenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)andthesequenceanalysisoftheV3RegionofI6SrRNAcombinedwithcanonicalcorrespondenceanalysistocharacterizethebact

11、eriaverticaldistributioncharaclerislicsandbacterialcommunitystructureinthesoilfromthreetypicalcontaminatedzonesintheNorthChinaPlain.Accordingtotheanalysisofphysicalandchemicalsoilpropertiesinpollutedareas,thereweresomedominantindividualbacteriainthekeypathwaysofthenitrogencycleandsulfatemetabolism.I

12、tissuggestedthatthebacterialcommunitiesareaffectedbythedistributionsofammonia,nitrateandnitritenitrogen,showingthatthecommunitystructureinfonnationofthedominantpopulationincontaminatedsoilisanimportantparametertostudytheammonianitrogenpollutionmigiationrules.Keywords:vadosezone；ammoniapollution；micr

13、obialcomniunities;DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)；16SrKNA27NicoleD,BrunoG,SteffenK.MethanolrophiccommunitiesinBrazilianFerralsolsfromnaturallyforested,afforested,andagriculturalsitesJ'.AppliedandEnvironinenial.Microbiology,2010(76)：1307-1310.DNA片段含量成正比。然而該技術的缺點在于,膠體條帶的分辨率影響部分條帶的生物信息，不

14、能獲取到全部的樣品微生物信息。此外16SrRNA克隆文庫分析也是有效鑒定樣品微生物分予生物技術,該方法能夠詳細地揭示樣本中微生物的多樣性,能夠將樣品微生物分類鑒定至種的水平。具體過程是將總DNA山樣本中提取出，應用通用引物對其進行16SrRNA基因的擴增.進而建立基因克隆文庫.再以限制性內切犧對其進行酶切自由，通過對其I6SrR、A基肉前切圖潛的分析鑒定微生物的具體分類，得到微生物群落多樣性的信息。針對DGGE技術有限分辨率造成的信息缺失以及克隆文庫分析的覆蓋范圍局限，本文將DGGE技術與克隆序列結合，對微生物群落豐富度的差異進行深層研究，同時通過典范對應分析對污染源區微生物群落多樣性及生態分

15、布特征進行評估，以期揭示氨氮污染源區包氣帶土壤理化性質對其細菌群落結構的塑造作用，為通過細菌生態系統變化反映污染物在包氣帶中的分布和遷移規律提供理論依據。1實驗部分11儀器和裝冒PCR擴增儀（CFX9，美國Bio-rad公司），凝膠成像分析系統（GelDocXR,美國Bio-rad公司），變性梯度凝膠電泳儀（DCode,美國Bio-rad公司），瓊脂糖凝膠電泳儀（DYCP-44P,北京六一儀器生產公司），小型高速臺式離心機（5418型，德國Eppdorf公司），高速冷凍離心機（3K3O,美國Sigma公司）,-80Y冰箱（美國ThennoElectronCorporation公司），高溫高壓滅

16、菌鍋（LDZM-60KCS,上海醫療器械廠），旋渦混合器（Vortex-Genie2T,美國ScientificIndustries公司），潔凈工作臺（SW-CJ-1FD,蘇州安泰），恒溫搖床（THZ-82A型，蘇州威爾），電熱恒溫水槽（DK8I）,上海風棱），電熱恒溫培養箱（D、P-9052,蘇州威爾），電子分析天平（AI204,美國梅特勒公司），哈納多參數測定儀（HI832O型，意大利Hanna公司）。12主要試劑去離子水（Millipore純化柱），丙烯酰胺（純度>99.0%,美國Sigma公司），雙丙烯酰胺（純度>99.9%,美國Promega公司），尿素（純度N99.5%

17、,美國Sigma公司）,Tris堿（純度'99.9%,美國Promega公司），EDTA二鈉（EDTA-Na2-2H20,純度"99.9%,美國Promega公司），去離子甲酰胺（純度99.5%,美國Amresco公司），甲酰胺（純度99.5%,美國Amresco公司），TEMED（純度N99%，美國Sigma公司），過硫酸被（純度N99.9%,美國Promega公司）,CTAB（生化級，純度N99.0%,美國Sigma公司）。乙酸（分析純，純度N99.5%）,乙醇（分析純,純度N99.7%）,NaOH（分析純，純度N99.5%）,甲醛（分析純，純度299.5%）,NaCl（

18、分析純，純度99.5%）,Na2HPO4（分析純，純度N99.5%）,KH2PO4（分析純，純度N99.5%）:這些試劑均購自北京化學試劑公司。EB（10mg/mL母液，上海生工生物有限公司）,FastDNASpinKitforSoil（美國公司）,DNA膠網收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）oTris-鹽酸溶液（1mol/L,pH8.0）：稱取Tris堿6.06g,加超純水40mL溶解，滴加濃鹽酸約2.1mL調pH至8.0,定容至50mLoEDTA（0.5mol/L,pH8.0）：稱取9.306g的EDTA二鈉，加超純水35mL,劇烈攪拌，用約1gNaOH顆粒調pH至8.0,定容至50mL

19、。TAE（50x）緩沖液：Tris-HC12mol/L,CTAB50minol/L,EDTA（0.5mol/L,pH=8.0）20mmol/L。PBS緩沖液（0.01mol/L,pH=7.4）配方:NaCl8g/L,KC10.2g/L,Na2HPO41.44g/L,KH,P040.24g/L0TE（1x）緩沖液：1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mL,0.5mmol/LEDTA（0.5mol/L,pH=8.0）0.2mL。超純水定容至100mL013場地概況與樣品采集采樣區位于華北平原溫榆河畔與北京城區之間，區域平均海拔約20m,上覆厚度為1015m黏土層，含水層為410m,具體由埋

20、深02m的雜性土壤層、埋深為210m的粉質黏土夾粉土層以及埋深為10-25m的粉砂-細沙層組成。取樣區域單層含水層厚度一般小于5m,部分地區可大于5m,累計厚度在20m左右，局部地段大于30m,整體滲透系數在30-50m/d之間。土壤樣品的采集點（T1、T2和T3）地處東經116°33北緯39。59,范圍內,】'】位點位于靠近城區的生活潛在污染區,T2位點位于市郊果蔬種植場地,T3位點為靠近溫榆河岸及垃圾填埋廠的污染區域。各站點土壤的野外采集完成后，迅速將樣品統一置于無菌盒中，貼好標簽密封，返回實驗室后置于-70無超低溫冰箱內長期保存，用于后續微生物計數和核酸提取。14樣品環

21、境因子測定土壤樣品pH值及電導率等參數利用哈納多H18320參數測定儀進行現場測定，顆粒組成、土壤含水率、三氮含量及其他化學成分由后期實驗測定,其他具體理化參數測定遵循表1所列的標準方法。表1上壤樣品環境因子測定方法Table1Determinationofenvironmentalfactorsinsoilsamples測試項目測試方法測試項目測試方法土填含水址質量法態氮、總貌紫外分光光度法pH值電化學分析法亞硝態氮N-（l-恭基）-乙二胺光度法縝化還原電位電位法131囪字電感耦合等離子體顆粒組成比收計法I4J罔丁發射光諧法鉉態氮納氏比色法其他陰離r離子色諳法1.5熒光染料（DAPI）i，t

22、數取0.5g凍存土樣和3.5mL無菌水，用勻漿器充分混勻，再加1.5mL含有0.05%TritonX-KX）的3xPBS緩沖液，750g離心1min（約2500r/min）,取1mL上清液，與3mL4%多聚甲醛均勻混合,4弋放置過夜以固定細胞。1mL細胞固定液中加染料DAPI至終濃度為200ng/mL,染色10min后用細幽濾器過濾，使菌體集中在0.22jun聚碳酸濾膜（Walemum濾膜）上,取下濾膜置于載玻片上迅速進行鏡檢;隨機計數10個視野中的菌體個數取平均值，計算出每克土樣中萌體細胞總數5。16樣品中總DNA提取及細菌16SrRNA-V3叮變區片段的擴增取5g凍存樣品裝入10mL離心管

23、中，加入4mL裂解緩沖液3%CTABJOOmmol/LTris-鹽酸（pH=8.0）,100mmol/LEDTA（pH8.0）,1.4mol/LNaCl,2%R筑基乙醇（V7U）,1%PVP,充分研磨,旋渦振蕩儀劇烈振蕩，盡雖使沉積物懸浮于裂解緩沖液中。加入蛋白麗K至終濃度1mg/mL,55勾溫浴1h,其間每15min補充一次蛋白酶K。將裂解后的上清液分裝到4個1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24：1）,以12000g轉速4Y離心10min,抽提兩次。取上清液加1/10體積3mol/L醋酸鈉和預冷的等體積異丙醇，于-20幻放置1h后以12000g的轉速4無離心29815mi

24、n,棄上清液，剩余沉淀用1mL70%乙醇洗滌一次，自然干燥，用50皿IxTE緩沖液（pH=8.0）溶解沉淀"門。利用16SrRNA-V3區引物341F/534R擴增樣品DNA序列，上游引物341F包括一段5黏性末端連接GC夾子結構的前導區，具體序列成分見表2i。PCR反應體系為：DNA模板I皿；引物10pmol；TaqDNA聚合的1U；2.5mol/LdNTP,4p.L；5xPCR緩沖液，10piL；Mg2+溶液1.6皿；去離了水補至50puLoPCR反應條件為：95丁預變性4min，然后94丁變性30s,55幻退火30$和72X延伸1min,共35個循環，最后72T延伸10mino

25、PCR反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的PCR產物利用產物純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）進行純化°表2引物序列Table2Primersequence引物序列34IF5'-CCTACCCCACGCAGCAG-3，534R5'-ATIACCGCGGCTCCTCC-3'34IF-GCS'一CCCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCCCGGGCACGCCCCGCCTACCGCAGGCAGCAG-3'MI3-475'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3，RV-M5*-ATTTAGGTGACACTATAGA

26、ATACTC-3'1.7細菌16SrRNAV3可變區片段的DGGE分肉與聚類分析將40jiL的16SrRNA-V3區PCR膠P）收產物，用變性梯度凝膠電泳儀（D-Codesystem,BIO-RAD,Hercules,CA,USA）進行DGGE分離,PAGE膠濃度為8%,變性梯度30%60%.60Y,80V電壓，1xTAE（20mmol/LTris基質，10mmol/L醋酸鈉,0.5mmol/LEDTA）緩沖液中運行13ho電泳后EB染色30min,置于凝膠成像儀紫外光下檢測并照相。利用NTsys軟件對DCGE凝膠電泳膠體上條帶位置及條帶亮度進行測定'，對DGGE條帶分離出的優

27、勢菌群進行LPGMA聚類及豐度分析，得到以皮爾森相似度為基礎的聚類分析結果，并通過離差平方和法繪制聚類樹狀圖。聚類樹狀圖中，縱軸站點兩個對象延長線交線垂直于橫軸相似系數，對應橫軸上的數據即為兩者之間的相似度。同樣,4個層位延長線與另外4個層位延長線的垂直交線對應數據.即為兩站點間的相似程度。1.8細御16SrRNA-V3區序列的克隆和測序紫外燈下對成型的DGGE凝膠進行檢測，將紫外光激發下可見的凝膠條帶切下，用去離子水沖洗3次后，浸入50似，去離子水中,4丁過夜沉淀。取各樣品浸出液2jxL為模板再次進行PCR擴增，二次PCR產物經膠回收試劑盒純化后，連接到PMD18-T載體（TAKARA，大連

28、）上,經熱激法轉化到大腸桿菌TOP10細胞中，涂布含有Amp/X-Gal/IPTG的LB平板,37勾靜置培養16ho然后4幻靜置Ih,使藍色充分顯現后，隨機調取白色函落到新的培養平板內過夜培養。隨機挑取單個白色菌落，加入含100jiLddH2O的PCR管內.置于PCR儀99丁加熱裂解細胞c取2皿裂解液作為模板，利用M13-47和RV-M為引物（具體序列列于表2）,進行后續的PCR擴增，驗證插入片斷的大小，篩選陽性克隆。將篩選好的陽性克隆保存于1mL含有20%H油的液體LB培養星中，每個平板隨機選取10株已得到驗證的陽性克隆進行測序（BGI,北京）o1.9典范對應分析（CCA）將三個站點土壤樣品

29、的理化因子數據，包括pH值、Eh值、含水率、硝態氮含筮、亞硝態氮含雖、氨態敏含量、紐離子及氯離含量，與克隆文庫測得的上壤細菌群落組成進行了典范對應分析,分為兩個數據矩陣,即土壤理化因子數據矩陣以及土壤細菌排落組成數據矩陣。通過Canoe。軟件計算分析出生態重要理化因了與土壤細菌群落分布之問的相丘影響關系,從而分析出單個環境因子對細弟群落組成的具體影響。1.10核酸序列世錄號通過隨機測序共獲得107個16SrRNA-V3區序列，利用Check-Chimera檢測（http:/cgis/llimera.cgi?su=SSL），將其中的嵌合體等不正常的序列剔除,81個

30、屬于正常序列。本實驗中采用的全部序列已提交到GenBank,序列號（AccessionNumber）為HQ916750HQ916804。111系統發育與統計分析獲得的16SrRNA-V3區序列通過BLAST工具從GenBank獲得與本實驗所得到序列親緣關系最近的類群序列。使用Thompson等"刁的方法對這些16SrRNA序列進行比對，然后利用MEGA3.0中的Neighbor-Joining模型進行系統發育與進化分析。并利用DOTUR軟件（以DNA序列間距劃分微生物分類及多樣性的軟件）版本1.53比較本實驗三個站點共12個土層樣品的細菌多樣性,將相似性298%的細菌I6SrRNA基

31、因序列歸為同一可操作分類單元（OUT）。2結果與討論2.1士壤樣品細曲總數統計及環境理化因素測定站點細電總數/酸堿度pH含水率/%代化還原電位Eli/mV干重mgkg'1)土峰巖性(CUFL)深度/mNH4-NNO,-Nno2-nSO?T1-1粉質黏土5.37x1091.948.7320.53247.002.240.460.0856.22Tl-2黏土夾砂7.27x10s3.278.7316.75201.000.520.470.1236.61T1-3粉細砂8.17xlO67.458.6318.34133.100.420.690.139.82Tl-4細砂2.64xI058.218.6817

32、.26107.200.531.960.126.62T2-1黏土8.87xlO90.958.1417.77566.0021.0422.2116.8819.04T2-2粉土1.53xl0R2.218.7117.75187.604.885.090.3524.38T2-3粉細砂8.31xlO64.008.333.83284.009.972.040.4349.83T2-4粉土9.53xIO68.158.569.83226.0066.5911.610.8133.2913-1黏上夾砂3.22xlO70.278.550.17491.000.464.561.34448.0513-2福土含砂1.54xlO81.2

33、38.6319.17372.00l.ll4.062.4729.10T3-3中細砂8.00xlO63.258.6218.0290.702.483.210.5945.75T3-4粗砂1.60xlO54.218.7316.8786.005.163.680.5228.00表3各點位土壤樣品理化參數及微生物數量統計Table3physicochemicalfactorsandmicroorganismsofsoilsamples實驗區三個站點土壤樣品的pH值均為8.0以上;含水量在各點的變化較小，均在15%以上;氨氮含量及硝基氮含在T2站點積累較為明顯,在站點T3積累其次，而T1站點三氮含量:檢出較站點

34、T2與T3明顯減少，亞硝氮在站點T3的表層位點含量較高，在T1站點及T2站點中沒有明顯積累;三個站點中硫酸鹽含量不均，在6.62448.05mg/kg之間（表3）。各站點12個土壤樣品中，土壤巖性細菌總數在1.6x1058.87xIO。范圍之內。研究區剖面上壤樣品各環境因素的測定結果表明，總氮及各類污染氮素的分布及含童在各采樣站點差異明顯，最高站點約是最低站點的60倍。取樣位點的土壤環境中NO2-N、NO-N、Nf-N、so：-等陰離了的含鼠過高，表明研究區土壤處于氮素及無機鹽類污染狀態，地下水環境極有可能因此受到威脅。其中，研究區T1位點土壤的總微生物量隨地層深度加深明顯減少，說明細菌數量隨

35、地層增加、有機質含量減少而減少。同時，表3數據還反映出，研究區內部水平方向微生物筋群分布基本均勻.但影響細菌總數的因素并不單-,研究區T2站點中深層位點（地下8m左右）與中層位點（地下3m左右）的細曲總量同屬一個數量級，說明其他土壤理化因素的改變，如污染氮素的異常積累、土壤含水率及溶氧技等同樣是影響土壤微生物總雖的關鍵因素。研究區站點同樣存在特例,表層的細菌總數略低地下淺層的細菌總數，說明土壤樣品中細菌的含雖并非隨地層加深而增多，站點中土壤顆粒組成變化仍是影響細前總量的主要因素。2.2基于DGGF：的微生物多樣性分析對研究區T1、T2及T3共12個土層進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）的測定，結

36、果表明三個站點的上壤細菌群落具有較為明顯的差異（如圖1所示）。12個泳道中產生的條帶均聚集在膠體的中間部位（該區域的變性濃度屬于高低混合）。DGGE膠體圖譜中共出現85條可見條帶，并標注出35條亮度明顯、位置清晰的DGGE膠體條帶，代表土壤樣品中優勢細菌16SrRNA目的片段，進行后續序列分析。DGGE膠體圖譜中，站點T1中表層土壤及淺層土壤的DGGE條帶分布較為相似，各層位條帶隨深度增加亮度降低、種類也相應減少，部分菌群（條帶1、3、4、6、8、9）表現尤為明顯。結合表3中各站點土壤理化參數分析，包氣帶土壤剖面表層至底層之間微生物多樣性發生的明顯改變，與層位加深后上壤顆粒結構改變造成的有機質

37、積累變化相關。同時表現在DGGE圖譜中，站點T2各層位的條帶隨層位加深變化并不明顯，除部分菌群（條帶17、18、19、21、24）為個別層位的特別優勢菌群外，其他菌群（條帶12、13、14、15、20）均貫穿于所有層位土壤之中，這與該位點各層位相似的土壤顆粒組成（表層至底層多以黏土及粉質黏土為主），及相似的污染物積累狀態（氮污染積累較為明顯）關系密切。站點T3在DGGE圖譜中的條帶分布表明,表300圖1三個站點12個層面上壤樣品16SrR、A-V3可變區的DGGE圖潛Fig.ID（；（；Eprofilesof（he16SrDNA-V3regionof（hrtwelvelayersalongth

38、esoilsamplethreestations層及淺層I.壤的細菌群落分布相似性很高，條帶2734所對應的細菌菌群在兩層位中的含量存在差異，而細菌種類兒乎沒有改變，但該層位見水較淺，且土壤顆粒變化較大，因此表層及淺層中大量存在的優勢細菌群落在位處淺層他水帶的13-3及T3-4層位中逐漸消亡，僅有少量優勢菌群存在（條帶29、30、31）并新增一種優勢菌（條帶35）,說明該位點土壤顆粒吸附細菌的能力隨土壤剖面加深而減弱，同時較深層位污染物濃度的增加,也是造成土壤剖而細菌多樣性分布差異明顯的主要原因。使用軟件NTsysVersion2.0131根據DGGE圖譜中每條帶所建立的矩陣進行聚類分析，通過

39、非加權組平均法（UPGMA）分析表明三個站點之間的群落結構相似程度均存在變化，聚類圖如圖2所示，橫線鏈接的末端垂線所對應的數值即為兩者的相似程度，如圖中站點T1表層Tl-1與T1-3的微生物群落結構最相近，相似度為90%左右。說明T1-3中部分微生物種群在較深地層仍然存在。地下淺層T1-2與表層T1-1相比，微生物群落結構變化稍明顯，相似度為86%。而隨著地層的加深，底層T1-4的微生物群落分布明顯不同于另外三層，相似度約只有75%。同樣站點T2各層位的微生物群落結構也存在差異,T2-2層與其他三層差別最明顯，相似度只有76%左右，而地層12-4與T2-I及T2-3兩層的群落結構相似度則保持在

40、80%以上，其中表層T2-1與地下深層T2-3的微生物群落結構相似度最高，達到88%。丫-變形簫酸桿菌7%放線菌3%擬桿菌4%厚壁南4%芽布桿菌5%產黃桿陶2%a-變形菌7%&變形菌7%綠彎菌3%站點層位|T1-1'TI-3TI-2ITI-4|T3-1T3-2一|T3-3T3-4T2-1IT2-3T2-4T2-20.570.650.730.800.880.96相似系數圖2DGGE分離所得細常I6SrRNA-V3|乂序列的NTSYS聚類圖Fig.2NTSYSdendrogrambasedon16SrRNA-V3regionsequencesfromDGGE站點T3的各層位群落結構

41、差異較為明顯，反映在圖譜中的成層分布差異較大。表層T3-1與T3-2之間的相似度達到96%,而深層T3-3與T3-4之間的群落結構相似度同樣為96%。但較淺兩層與較深兩層之間的差異明顯，只達到80%,說明淺層與深層土壤剖而的微生物群落結構變化較大。反映在三個站點之間的群落結構相似性，站點T1與站點T3的群落結構較為接近，相似度達到75%,而站點T2與其他兩個站點T1、T3差異較大，相似度只有57%。說明微生物菌群在站點T1及T2之間變化不大，但站點T3與站點T1及T2的細曲.群落結構分布差異均比較明顯，原因在于站點T3緊靠溫榆河畔，包氣帶地層見水層位較淺，土質成多為砂質土壤，造成站點T3的微生

42、物群落結構變化明顯。2.3細菌群落結構及系統發育分析將DGGE分離出的優勢細兩條帶（分別標記為條帶135）在NCBI基因庫（NCBI,/）中進行序列比對發現，實驗區12個土壤樣品中提取出的81個正常細菌16SrRNA序列共54個不同親緣類型（OUT）,分屬于11個系統發育門類。如圖3所示，各分屬具體細菌門類及所占細菌總親緣類型比例分別為：a-變形細茜（7%）,8-變形細菌（10%）"-變形細菌（25%）,S-變形細菌（7%）壁前（4%），酸桿菌（7%）,放線菌（3%），綠彎菌（3%）,擬桿菌（4%）,產黃桿曲（2%），芽單胞幽（5%

43、）和未分類細菌（26%基于16SrDNA基因序列相似性298%的準則，0變形菌未分類細菌26%a-變形菌綠彎菌。酸桿蔭8變形菌厚壁菌擬桿蔭Y-變形菌產黃桿菌芽弛桿菌&變形菌放線維未分類細茜圖3研究區三站點各層位總微生物胖落組成Fig.3Microbialcommunitycompositionofsoilhorizonsfromthreestationsinresearcharea選取DGGE圖譜（圖1）中得到的部分代表條帶進行序列系統發育分析，結果表明細菌類群在不同站點和層位中的分布存在顯著差異。如圖4所示,T1站點4個層位樣品中的優勢細菌類群是y-變形細萌（代表條帶3、7）,3-變

44、形細菌（代表條帶2、8）-變形細菌（代表條帶5）,綠彎菌（代表條帶1），厚壁菌（代表條帶4、9）和芽抱桿菌（代表條帶6）,另外在該站點深層區域T1-4上壤樣品中，檢出少量產黃桿萌（代表條帶10）和放線菌（代表條帶11）。根據測序結果，發現該站點土壤總細弟中y-變形細菌在所占比例最大為36.4%,其次是厚壁菌和3-變形細菌（占到18.2%），綠彎菌占到13.6%，芽弛桿菌所占比例為9%,產黃桿笛及放線菌所占總菌類的比例僅為4.5%，其余菌種屬于未分類細菌。隨著深度的增加.底層T1-4中的優勢細菌主要為產黃桿前。該站點由于表層覆蓋建筑垃圾雜填土，淺層土壤顆粒為粉質黏土，深層主要由粉細砂、細砂組成。

45、地卜,污染氮素及以硫酸根高子為代表的無機鹽在粉質黏土及黏土層積累明顯，在以細砂為主的土層中含最迅速降低,y-變形細曲占絕對優勢。另外厚壁街、5-變形細菌、芽弛桿菌和綠彎菌同樣是表層的優勢細萌群，其中厚壁菌類細南與來自植物根系土壤的細菌親緣性較高），尤其發現一類異養脫氮細菌Bacillussp,菌屬與氮循環密切相0000.«.、/、Z7ZVzz/-L80206040i11.z/A1蓍1A!11z.，/'/ii£|1£a1sl1§811*未分類細的芽抱桿情擬桿摘酸桿倆口放線菌H產黃桿菌厚壁的綠彎的方變形菌大變形前a缶變形菌甲變形菌T2.22-32-.

46、4T2T33T3-4n圖4三個站點各層位細偶組成統計Fig.4Bacterialcom|w）sitionfromthreestationsinresearcharea關|叫。另有分屬于5-變形菌的除硫單胞菌屬（Desulfuromonas）被認為在硫循環中具有重要的作用“，同樣僅存在于土質為粉質黏土和黏土夾細砂的Tl-1及T1-2層位中，說明相對砂質土壤硫酸根離子-蓄積量較高的黏七質土壤為是該類細菌.生存的首選環境,T2站點4個層位樣品中的優勢細菌類群是變形細菌（代表條帶I4、23）,y-變形細|將（代表條帶12、19、24、25）,a-變形細菌（代表條帶20,21）.擬桿菌（代表條帶15.2

47、2）,5-變形細菌（代表條帶I6J7、】8）,產黃桿菌（代表條帶26）和酸桿菌（代表條帶13）o序列測試結果顯示，各類細菌所占該站點總菌比例分別為/?-變形細菌（21.6%）、y-變形細菌（19.6%）、a-變形細菌（17.6%）、擬桿菌（17.6%）、5-變形細菌（5.9%）、酸桿菌（7.8%）和產黃桿菌（2%）.其余屬于未分類細菌。該站點位于長期受到含氮類農藥污染的城郊果蔬種植園,分析其土壤環境發現，該區域氨態氮積累極為嚴重，尤其在地卜淺層與飽和帶之間積累更加顯著。硝態氮及亞硝態氮含量隨層位加深呈遞減趨勢,說明在這些層位的土壤微環境中發生了較為明顯的反硝化作用，其中占絕對優勢的細菌均屬于反

48、硝化細菌類別，如假單胞菌和反硝化|W（ParacoccusfMintotrophusATCC35512）O此類細菌能夠利用硝酸根、亞硝酸根、氮釵化物作為末端電子受體，以還原性硫化物為能源生長F-22.進而解釋了站點T2中亞硝態瓶隨層位增加的現象。另外，分屬變形菌y亞綱的高度耐鹽W鹽單胞菌（Hulonunwssp.）生存于硫酸鹽含原較高的T2站點粉質土壤中，與其親緣關系最近的物種來自于苯乙酸廢水的高鹽污泥'，這類細菌的存在多數受污染鹽類含量的影響。T2站點的各層位中還存在著各類有機污染的降解菌，如分屬于3-變形細菌的地桿菌（Geobaeteraceae）、放線菌、變形菌以及擬桿菌等，這些

49、門類的細菌多來自混合污染土壤及淤泥中：24_251o但草地土壤街、農田）等環境的常見細菌綠彎菌、芽抱桿曲及厚壁菌未在T2站點中檢出。T3站點4個層位樣品中y-變形細菌（代表條帶30、31、32、35）占較大優勢，是總菌量的17.6%,6-變形細幽（代表條帶33）愣-變形細曲.（代表條帶28）、芽抱桿菌（代表條帶29）、擬桿菌（代表條帶34）和酸桿菌（代表條帶27）所占比例均在8.0%左右，厚壁兩及產黃桿菌所占比例僅為2.1%,其余曲種屬于未分類細菌。毗鄰河道的站點T3,與站點T1及T2相比，飽水帶層位較淺，土壤密度較大,砂含量較高。由于主要顆粒幻成為粉土夾粉細砂的表層土壤T1，相比有黏土夾層的

50、淺層土壤12積累污染物質及吸附微生物的能力略差，剖面表層T3-1、T3-2層位的優勢細菌群組成屬于群落多樣性較為豐富的一層。站位T3氨態氮含量由淺層到深層飽和層逐漸增加，黏質土壤層位T3-1中硝態知及亞硝態氮也有明顯積累,微生物數量和種類較為豐富。但隨著層位的加深,土壤受污染程度加大，包氣帶砂質土壤中微生物吸附能力衰減，使微生物尤其是優勢硝化菌群減種類大幅下降，硝化反應程度減弱，氨態氮轉化為硝態氮及亞硝態氮的程度也連鎖性降低，造成細菌的群落多樣性隨著取樣地層的加深而明顯減少。2.4細慎類群的分布與環境因*的典范對應分析（CCA）各站點三氮雖、含水率、pH值、總氮、陰離子含珀等環境因子與克隆文庫

51、細菌群落的典范對應分析結果顯示（圖5）,實驗區各采樣站點微生物組成在二維排序圖上的分布與各種理化因子具有一定的聯系。位于二維排序圖左上方的物種有變形菌、放線萌、芽單胞菌和擬桿菌等,在實驗區土壤中的分布與總氮含成呈明顯正相關。放線菌及a-變形幽的分布與陰離子因素有一定的相關性，同時。-變形菌門與硝基氮含最顯著正相關，而亞硝基氮含量及氨敏含量是影響排序圖中右下方變形萌分布的關鍵參數。5-變形細菌和含水最具有顯著的正相關性，與其他陰高于因素，如氟離子等，也有一'定的相關性，表明這類細菌主要分布在鹽類含量較高的地區。圖5左下方的綠彎菌、壁厚菌受含水量及pH值影響較大,這兩種參數值的平穩與否決定

52、了兩類萌群生長的狀態。實驗區存在的未分類菌群分布受pH值及含水量影響較大，同時與亞硝基氮及氨短含址呈負相關。圖5實驗區三位點中各細儡類群與環境關系的CCA二維排序圖Fig.5CCAbiplotofsamplesandenvironmentalfactorsfromthreestationsofresearcharea圖中各箭頭標注代表的環境因子為:TN一總氮；Eh軾化還原電位;NO；-N暗基氮；NO；-N-亞硝基氮；NH；-N-氨氮；WC含水缺；pH-pH值；FCl"-MT；SOf-硫酸根離;NO；-無機鹽硝酸根。三角圖拆代表文庫所包含的所有微生物種群分屬的門類:Act放線菌；Un未

53、分類序列；gay-變形Bal擬桿菌；aia-變形菌；be尸-變形州deS-變形菌；Fir-壁厚菌；Chi一綠彎菌；Gem芽單胞菌；Fla-產黃桿爵3結語本研究樣品所處的地下水系統中具有顯著的空間特異性，地下水系統中微生物群落沿不同地層的成層分布特征與地球化學特征的成層分布相吻合。地下微環境中存在的微生物群落多為與氮循環有關的優勢細菌個體，而總體群落結構分析表明該區域存在的微生物及其群落還參與著生態系統中硫酸鹽等無機離子代謝的過程。研究結果表明研究區各站點土壤顆粒結構是影響包氣帶環境中多種污染物遷移轉化及微生物群落多樣性的關鍵，污染物在土層中的分布變化是細前群落結構更替的主要驅動力，而土壤中的微

54、生物也是污染物遷移過程中不可或缺的作用因素。通過對細菌群落結構分布與包y帶土壤環境的地球化學性質分析，本研究揭示了地下水微環境中典型污染物遷移與細慎生態系統具有密切相關性，將為進一步研究包氣帶土壤理化參數對地下水環境的影響奠定基礎。4參考文獻:IWilliamJII.Vadosczonemierobialbioliarriersremovenitratefrompercolatinggroundwater'J.CurrentMicrobiology,2009(58)：622-627.'2MamieNI.KateMS,DennisER.Reductionofperrhloralt

55、*andnitratebymicrobialcommunitiesinvadosesoil:J.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2005,71(7)；3928-3934.3 卞華松，張仲燕.冷凍固定化優勢萌群處理含甲醛苯酚廢水J.環境科學,1998.19(2)：39-42.4 趙娟.呂劍，何義亮，靳強.張文英，何霞.異養脫敏菌株Bacillus$p.LY降解有毒有機污染物的研究J.環境科學.2007,28(12):2838-2842.5 袁勇軍.陸兆新，黃麗金.呂鳳霞.別小妹.煙堿降解細菌的分離鑒定及其降解性能的初步研究J.微生物學報,2005.45(2

56、)：181-184.6 洪青.張忠輝.張曉舟.徐劍宏.李順胳.中度嗜鹽偏Halomonassp.BYS21啟動子的克隆和測序J.應用與環境生物學報,2005,11(6)：729-732.7 MyersBM,FischerSG,ManiatisT.M(HlificationofIhemeltingpropertiesofduplexDNAbyattachmentofaGC-richDNAsequenceasdeterminedbydenaturinggradientgelelectrophoresis_JJ.NucleicAcidsResearch,1985,13：3111-3129.I8Muy

57、zerG,BrinkhoffT,NubelU.Denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)inmicrobialecologyJ.MolecularMicrobialEcologyManual,1998,3(44)：I-27.91ZweifelUL,HagstrornA.Totalcountsofmarinebaderiaincludealargefra(*tionofnon-nucleoid-containingIwiclrria(ghosts)J1.AppliedandEnviron-mentalMicrobiology,1995.61(6)：2180-2185.10SchallenbeiM,Kalfl*J,RasmussenJB.Solutionstoproblemsinenumeratingsedimentbacteriabydirectcount.J.Applie