1、臨床微生物檢驗在感染診治方法中作用234Click to edit Master title styleClick to edit Master subtitle style主要議題：微生物室的概況耐藥監測，幫助醫生經驗選藥規范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論6內容提要內容提要一.微生物室的概況實驗室面積：70+m2 （標本接收室、接種室、儀器操作間、培養基制備間、資料庫房）人員：共3人，1-2人/天主要儀器設備：德靈 Microscan Walk/Away-40全自動微生物鑒定和藥敏試驗分析系統BD公司BACTEC 9120 全自動血培養系統ATB半自動細菌鑒

2、定和藥敏分析系統（ATB-STREP 5、ATB-HAEMO）78一.微生物室的概況現今的微生物實驗室大體分為三大部分：傳統微生物檢測技術（涂片、培養、鑒定和藥敏）非傳統微生物檢測技術（免疫學方法）分子生物學檢測技術（基因測序、耐藥基因檢測等） 9一.微生物室的概況基于涂片染色+鏡檢的微生物檢查是微生物檢驗中古老但非常有效非常有效的方法。 顯微鏡鏡檢不僅可以迅速了解標本中有無病原體，而且可根據其形態和著色性進行初步分類，為臨床經驗用藥臨床經驗用藥提供依據。涂片檢查結果對臨床早期診斷和治療早期診斷和治療有十分重要的意義。n 培養培養根據標本的種類和培養目的來選擇不同的培養方法，如常規CO2培養，

3、尿液定量培養方法，多重耐藥菌需選擇性培養基，以及厭氧培養等。n 涂片涂片n 流行病學資料流行病學資料指導本院的臨床用藥預測耐藥發展趨勢有目的的科研方向經驗診斷中的經驗診斷中的依據依據一.微生物室的概況直接鏡檢法和培養檢查法是形態學檢查的基本方法，我們不應該輕視形態學，特別是直接鏡檢法和培養檢查法是形態學檢查的基本方法，我們不應該輕視形態學，特別是“鏡鏡檢檢”、而片面的去追求一些尚不成熟的、而片面的去追求一些尚不成熟的“新技術新技術”。11一.微生物室的概況強調一下，鏡檢及培養的重要臨床意義：強調一下，鏡檢及培養的重要臨床意義：直接鏡檢簡單、快速、實用直接鏡檢簡單、快速、實用1.評價送檢標本質量

4、評價送檢標本質量2.對臨床快診快報對臨床快診快報3.評價培養質量評價培養質量4.對培養物鑒定藥敏有導航的作用對培養物鑒定藥敏有導航的作用5.簡單、常規的工作卻需要經驗的積累和責任心簡單、常規的工作卻需要經驗的積累和責任心.6.但陽性率較低，陰性結果不能排除診斷但陽性率較低，陰性結果不能排除診斷12一.微生物室的概況鏡檢及培養的重要臨床意義：鏡檢及培養的重要臨床意義：培養作為直接涂片的后續步驟，其目的是為了：培養作為直接涂片的后續步驟，其目的是為了： 進一步提高對病原體檢出的陽性率進一步提高對病原體檢出的陽性率驗證直接鏡檢的結果驗證直接鏡檢的結果同時確定致病菌的種類同時確定致病菌的種類1.1.

5、但所需時間較長但所需時間較長必須強調直接鏡檢與培養檢查相結合的重要性！13必須強調直接鏡檢與培養檢查相結合的重要性！涂片和培養二者相輔相成缺一不可！涂片和培養二者相輔相成缺一不可！14內容提要內容提要主要議題：微生物室的概況耐藥監測，幫助醫生經驗選藥規范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論病原譜抗菌藥物選擇的決定性因素之一15社區獲得性感染常見類型lCAPlAECOPDlUTIl皮膚軟組織感染醫院感染常見類型l HAPl BSIl CAUTIl SSI(含腹腔感染、術后腦膜炎)醫生需要什么樣的病原譜信息呢？16這樣的信息對臨床治療決策有意義嗎？這樣的信息對臨床治療決

6、策有意義嗎？針對性病原譜信息對臨床決策有價值17MRSA（耐甲氧西林的金葡）占金葡中87.8%抗菌藥物敏感性監測數據現有大量的抗菌藥物敏感性監測數據國家層面：CHINET、全國細菌耐藥監測網（CARSS）地區層面：多家醫院數據匯總醫院層面：微生物提供的全院數據科室層面：微生物提供的重點科室（如ICU、感染科、呼吸科）的分科室數據18目前抗菌藥物敏感性監測數據的利與弊利：有助于制定抗菌藥物管理政策（如限制某些藥物使用）有助于確定感控中監測的目標菌（如CRE、VRE）弊菌株的臨床意義不明（可能是感染、定植和污染）質控較差（含有大量痰、分泌物等低質量的標本）未能按感染類型分類使用抗菌藥物后耐藥菌易分

7、離19目前的敏感性監測數據對個體治療決策的幫助小，臨床需要的不是大而全的監測數據，而是結果疾病譜的耐藥性監測數據：20社區獲得性感染：地區數據lCAPlAECOPDlUTIl皮膚軟組織感染醫院感染：本院數據l HAPl BSIl CAUTIl SSI(含腹腔感染、術后腦膜炎)21內容提要內容提要主要議題：微生物室的概況耐藥監測，幫助醫生經驗選藥規范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論規范微生物標本采集規范微生物標本采集22微生物檢查的標本收集原則無菌采集無菌采集無菌容器無菌容器及時足量及時足量迅速送檢迅速送檢23及時運送苛養菌中除卡他莫拉菌外，流感嗜血桿菌和肺炎鏈球

8、菌對干燥、寒冷的抵抗力均較弱，在標本離開機體后其存活率十分低。對環境抵抗強的細菌（銅綠假單胞及其他G陰性菌、葡萄球菌、念珠菌等）2-4h繁殖數代，影響定量結果。24送檢標本種類與臨床意義l臨床意義較低的標本： 痰、咽拭子（HI、SP、A鏈、溶血隱秘桿菌除外） 糞便、肛拭子（致腹瀉病原菌和艱難梭菌CD）l臨床意義中等的標本： 尿 膿液、傷口分泌物l臨床意義較大的標本： 血、CSF、胸腹水、及其他無菌體液25常見標本類型的案例分享常見標本類型的案例分享26常見標本類型的案例分享CASE1：2015/11/25 2015/11/25 病人：男性病人：男性 感染科感染科-082-082床床 肺吸蟲病肺

9、吸蟲病 標本：痰標本：痰 . .CD4TCD4T淋巴細胞：淋巴細胞：1/ul1/ulESRESR：78mm78mmCRPCRP：107mg/L107mg/LPCTPCT：0.88ug/L0.88ug/L2728在合格的痰標本里發現在合格的痰標本里發現“有隔菌絲有隔菌絲”，是比較有臨床意義的！于是把，是比較有臨床意義的！于是把痰標本接種了痰標本接種了SDASDA、血平板。、血平板。2 2天后血平板優勢生長出了絲狀真菌。天后血平板優勢生長出了絲狀真菌。292 2天的血平板棉蘭染色，顯微鏡觀察如下圖：天的血平板棉蘭染色，顯微鏡觀察如下圖：因鏡下形態曲霉特因鏡下形態曲霉特征明顯，但單純靠征明顯，但單純

10、靠血平板和目前所觀血平板和目前所觀察到的鏡下形態難察到的鏡下形態難以鑒定為啥曲霉？以鑒定為啥曲霉？隨后進行了隨后進行了PDA的的轉種。轉種。30PDAPDA平板四天時的菌落和鏡下形態如下圖：平板四天時的菌落和鏡下形態如下圖：根據菌落和鏡下特點，傾向于土曲霉，但菌落顏色因時間的關系，仍不夠典型，續孵。根據菌落和鏡下特點，傾向于土曲霉，但菌落顏色因時間的關系，仍不夠典型，續孵。31PDAPDA平板六天時的菌落形態如下圖：平板六天時的菌落形態如下圖：典型的泥土色菌落出現，典型的泥土色菌落出現，確定為確定為“土曲霉菌土曲霉菌”。CASE2：腎病科 藥物毒性反應 男 編號：1779和1780 連續兩次抗

11、酸染色3210%NAOH10%NAOH消化痰液后低速離心鏡檢消化痰液后低速離心鏡檢3310%NAOH10%NAOH消化痰液后低速離心鏡檢消化痰液后低速離心鏡檢鏡下發現的菌絲進行革蘭染色鏡下發現的菌絲進行革蘭染色 如上圖如上圖把兩個標本都進行了真菌培養，接種了血平板。把兩個標本都進行了真菌培養，接種了血平板。血平板培養48h后，菌落如下：從平板中可以看出兩者是幾乎是一樣的絲狀真菌生長，于是都分別轉種了SDA平板。341779 48h35轉種SDA后4d的生長情況1779 號號1780 號號361779 號號當即做了棉蘭染色，如上圖當即做了棉蘭染色，如上圖煙曲霉菌煙曲霉菌簡單、常規的工作卻需要經驗

12、的積累和責任心簡單、常規的工作卻需要經驗的積累和責任心.3738曲霉菌屬曲霉是一類絲狀真菌，自然界中廣泛存在。常可以再泥土、植物腐物、空氣中等處分離到。其引起的人類疾病可分為機會性感染、變態反應性曲霉病及曲霉毒素中毒。免疫受損免疫受損是曲霉機會性感染最常見的原因。感染可以表現為局限性的曲霉球到嚴重的侵襲性感染侵襲性感染。39與侵襲性曲霉病發病相關的主要危險因素有：與侵襲性曲霉病發病相關的主要危險因素有：中性粒細胞及巨噬細胞數量減少或功能異常；骨髓造血干細胞及實體器官移植、腫瘤放化療、COPD、ICU機械通氣以及長期使用糖皮質激素、細胞毒藥物等免疫功能受損的患者。檢驗結果的解釋：檢驗結果的解釋：

13、曲霉菌為條件致病菌，自然界糞便廣泛，某些菌可以成為實驗室污染菌。因此曲曲霉菌為條件致病菌，自然界糞便廣泛，某些菌可以成為實驗室污染菌。因此曲霉菌分離結果需要謹慎對待。結合鏡檢結果判斷培養得到的曲霉是否具有臨床意霉菌分離結果需要謹慎對待。結合鏡檢結果判斷培養得到的曲霉是否具有臨床意義，一般來說以下幾種形式被認為具有臨床意義：義，一般來說以下幾種形式被認為具有臨床意義：1.1.無菌部位或下呼吸道臨床標本中發現菌絲；無菌部位或下呼吸道臨床標本中發現菌絲；2.2.單一標本中為優勢菌或者多次標本中分離得到同一菌株；單一標本中為優勢菌或者多次標本中分離得到同一菌株；3.3.組織中發現菌絲。組織中發現菌絲。

14、注意：當懷疑肺部真菌感染的時候，最好連續培養三次痰標本。痰液中分注意：當懷疑肺部真菌感染的時候，最好連續培養三次痰標本。痰液中分離出的曲霉菌則應結合直接鏡檢結果進行考慮，離出的曲霉菌則應結合直接鏡檢結果進行考慮，涂片細胞學檢查為合格的涂片細胞學檢查為合格的痰標本，且初始分離培養基上呈優勢生長可作為臨床診斷的依據。痰標本，且初始分離培養基上呈優勢生長可作為臨床診斷的依據。41CASE 3 :2015.12.27 上午10點，患者:張某 “反復腰背疼痛半月，加重伴起臥困難3天”入院。入院前半月，患者無明顯誘因開始出現腰背部疼痛，間歇性疼痛，持續時間長短不一，休息后可緩解。既往康健，無不良個人史。輔

15、助檢查：MRI顯示腰4/5椎間盤突出，腰4椎體失穩，腰椎側凸畸形。血常規：正常，ESR：31mm/h 27日下午14時，反復高熱，最高達39.7，送檢血培養血培養28日心內科、感染科會診：發熱待診。感染性心內膜炎可能性小，不排除血流感染，建議進一步檢查。29日彩超：雙側腋窩查見淋巴結（結構異常）。血PCT：0.43ng/ml HS-CRP：39.18mg/L。30日，血液科會診，發熱待診，原因不明，轉入血液科，行骨髓穿刺送檢，結果正常。診斷陷入糾結，發熱原因何在？感染？非感染？診斷陷入糾結，發熱原因何在？感染？非感染？接收了血培養的微生物室呢？421.1下午發現儀器報陽（+）進行了常規涂片和轉

16、種，但涂片革蘭染色：未見細菌。1.2轉種平板未見明顯生長。思考？思考？1.血培養瓶4-5天報陽，假陽性？真陽性？2.革蘭染色未見細菌是真的無菌嗎？3.骨科病人，有骨骼和關節損傷可能。4.血平板24h未見明顯生長，是生長緩慢？還是真的也無菌生長？生長曲線43108.96h報陽，報陽，4.5d，明顯的倒，明顯的倒S行，符合真陽性表現。行，符合真陽性表現。報陽瓶再次涂片革蘭染色44查見可疑“細菌團”。45報陽瓶再次涂片瑞氏染色清晰可見“沙堆狀”紫色細菌團。再次轉種的普通巧克力平板46布魯氏菌屬觸酶：陽性氧化酶：陽性吲哚試驗：陰性有上述生化反應特征且2h內脲酶陽性的微生物應被推定為布魯氏菌種!并應立即

17、采取生物恐怖預防措施！布魯菌-人畜共患病原菌47布魯菌布魯菌容易感染豬、羊、牛等家畜，人類與病畜接觸或食用病畜肉、奶及奶制品而被感染。Brucellosis,布病布病：也稱“波狀熱”“馬耳他熱”或“地中海池張熱”，是布魯菌引起的急性或慢性傳染病，屬于自然源性疾病，主要表現為：發熱、多汗、乏力、關節痛可逐漸轉為慢性，侵襲骨骼系統、中樞神經系統、呼吸道、胃腸道、心血管系統和皮膚。48內容提要內容提要主要議題：微生物室的概況耐藥監測，幫助醫生經驗選藥規范標本采集及常見標本類型的案例分享臨床與微生物檢驗中常見問題的討論一、涂片鏡檢結果與培養結果不吻合？1、涂片結果是報告所有檢見病原菌，而培養的目的是檢

18、出致病菌，因此會產生不一致的情況；2、一些苛養菌需要在特殊環境或培養基上生長，因此常規培養不一定能得到結果。臨床與微生物檢驗中常見問題的討論取的明顯是膿液標本，為何培養報告為無菌生長？1、常規培養為需氧培養，膿液可能來自厭氧菌感染；2、病原菌可能被大量的中性粒細胞吞噬。二、未破裂膿腫：消毒覆于膿腫表面的皮膚，用注射器將膿腫內容物吸出，注射器針頭扎入無菌橡膠瓶蓋（青霉素小瓶橡膠塞）。-厭氧培養or需氧培養開放病灶和膿腫：不建議做厭氧培養；用無菌生理鹽水或70%酒精擦拭除去表面分泌物，盡量去除表面菌群，用拭子采集病灶底部或邊緣的標本，置于需氧培養基中。-需氧培養臨床與微生物檢驗中常見問題的討論三、

19、一般培養三天出結果，為何第四天還沒有結果？常規流程：將標本接種于不同的培養基，在培養箱中進行培養，24h后觀察培養皿中生長情況，此時若無病原菌生長，繼續放回培養箱中培養24h，若任無細菌生長則判定為陰性結果，因此常規培養報告時間為3天。第四天出報告：臨床與微生物檢驗中常見問題的討論四、今天的培養結果與前一天的不一樣？1、取材是否一致；2、痰標本，選擇優勢菌做鑒定藥敏，就可能導致兩次結果不一致。痰標本中：銅綠、金葡腸桿菌（肺克）鮑曼痰中常見的定植菌或污染菌l念珠菌（如果沒有其他部位培養陽性）l嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌l凝固酶陰性葡萄球菌l弗勞地檸檬酸菌（枸櫞酸菌）和陰溝腸桿l腸球菌l木

20、糖氧化產堿桿菌臨床與微生物檢驗中常見問題的討論五、明顯是稀便，培養結果為何正常？大便培養，通常只能鑒定志賀菌、沙門菌感染，很少醫院常備致病性大腸桿菌鑒定血清，很少醫院能夠做艱難梭菌培養，很少醫院能常備霍亂弧菌血清。與國際微生物檢驗的差距-缺項1.艱難梭菌：醫院感染常見病原菌，一些發達國家中排名第一2. 肺炎鏈球菌3. 軍團菌4. 非典型分支桿菌5. 呼吸道感染病毒臨床與微生物檢驗中常見問題的討論六、培養報告上寫著四聯球菌、類白喉棒狀桿菌，為何沒有藥敏結果？1、四聯球菌為微球菌、類白喉棒狀桿菌，一般不引起人體致病，為非致病菌，故考慮污染可能；2、藥敏結果需參照CLSI標準，目前微球菌沒有參照標準

21、，故暫不能做藥敏試驗，若需治療可參照陽性球菌用藥。“若僅從一份血培養中分離出凝固酶陰性葡萄球菌，不必常規做藥敏試驗，因為這種菌經常認為是血培養中的皮膚污染，假如需要做藥敏，請在24小時內聯系實驗室。”兒童除外臨床與微生物檢驗中常見問題的討論培養陽性的病原菌都需要用抗菌藥物治療嗎？1、不是；2、培養陽性感染，可能為污染（血培養），可能為定植（痰培養）；3、任何結果必須結合臨床情況進行評價（重要）；4、感染部位的清創、引流、換藥比使用抗菌藥更重要；5、改善患者全身情況：器官功能支持、糾正酸堿平衡、電解質紊亂、低蛋白血癥、高血糖等。七、臨床與微生物檢驗中常見問題的討論臨床想用的藥物在藥敏試驗中沒有做

22、？1、可能是天然耐藥2、可能是藥敏板沒有包括該藥3、可能是該藥敏感性被其他藥物所預報是否能將所用的藥物都做抗菌藥物敏感試驗？1、沒有必要：通過耐藥機制和標志性藥物可以預測其他藥物的敏感性。2、沒有可能：藥敏藥物需要在體外穩定，需要有操作標準和解釋標準。八、九、臨床與微生物檢驗中常見問題的討論天然耐藥：天然耐藥：腸球菌： 對除青、氨芐以外的所有青霉素類、頭孢菌素類天然耐藥。肺炎鏈球菌：對氨基糖苷類天然耐藥。嗜麥芽窄食單胞菌：碳青霉烯類天然耐藥。肺炎克雷伯菌：對氨芐西林天然耐藥。陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌：對頭孢西丁天然耐藥。銅綠假單胞菌：銅綠假單胞菌：對氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉維酸、復方新

23、諾明、1、2代頭孢天然耐藥。對三代頭孢（噻肟、曲松）即使藥敏試驗敏感，在實際里程治療中也需要超大劑量才會取得療效。頭孢中僅他啶和吡肟。銅綠假單胞菌有對跟多藥物的誘導耐藥性，在體外試驗可能沒有表現出來，但一旦接觸某種抗生素，其沉默的耐藥基因可能被誘導激活，耐藥性則表現出來，這種特性在-內酰胺抗生素中尤為明顯，可導致體外敏感，但實際治療卻無效。臨床與微生物檢驗中常見問題的討論耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌發生率耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌發生率 耐碳青霉烯類用量耐碳青霉烯類用量對碳青霉烯類耐藥或中介敏感銅綠假單胞菌比例(%)碳青霉烯類用量(DDD/1000床-日)中部地區中部地區西南地區西南地區東部地區東部地區碳青霉烯的用量與碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌的檢出率正相關，碳青霉烯的用量與碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌的檢出率正相關，r=0.63r=0.63，P0.01P0.01Plss-Suard C,et al.Antimicrob Agents Chemother. 20