1、二甲雙胍對糖尿病大鼠心肌病變的抗氧化保護作用    【摘要】  目的 探討二甲雙胍(MT)對2型糖尿病大鼠心肌病變的抗氧化保護作用。方法 雄性SD大鼠45只，高脂高糖喂養6周后，予以鏈脲佐菌素(STZ)35mg/kg腹腔注射制備2型糖尿病動物模型，隨機分為對照組(CG)、單純糖尿病組(DG)、小劑量MT干預組(SM，100mg/kg·d灌胃)及大劑量MT干預組(LM，300mg/kg.d灌胃)，灌胃12周后，血清檢測胰島素(INS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CH)及游離脂肪酸(FFA)，心肌勻漿檢測超氧化物歧化酶(SOD)及丙

2、二醛(MDA)水平，應用免疫組織化學方法測定核因子(NF-B p65)及環氧化酶-2(COX-2)在心肌中的表達，并觀察各組心肌細胞超微結構變化。結果 1)與對照組比較，DG組體重明顯減輕，血糖、心臟質量指數、INS、TG、T-CH及FFA明顯升高(P0.01)；應用MT治療后體重無明顯增加，INS有所下降，心臟質量指數、血糖、TG及FFA明顯降低(P0.01)；DG組心肌組織MDA明顯升高，SOD明顯降低(P0.01)，MT治療后上述指標明顯改善；2)超微結構觀察單純糖尿病組肌絲結構明顯紊亂，典型肌小節結構消失，線粒體腫脹、間質纖維增生，微血管內皮細胞腫脹等表現，而SM及LM組可見組織結構有

3、所改善；3)對照組心肌NF-B p65及COX-2只有少量表達，單純糖尿病組表達量明顯增多(P0.01)，MT治療后表達量明顯減少(P0.01)。結論 MT對糖尿病心肌病變具有保護作用，可能與其減弱脂質的過氧化反應，減少NF-B及COX-2的表達有關。 【關鍵詞】  二甲雙胍；糖尿病大鼠；心肌；抗氧化Obstract： Objective  To explore the protective effect and investigate anti-oxidative stress mechanism of metformin on diabetic myocardial d

4、amage in rats. Methods  The model of diabetes in 45 male SD rats was establised through intraperitoneal injection streptozotoch(STZ) 35mg/kg after six weeks by feeding high fat and high glucose food. 45 rats were randomly divided into control group group(CG)、Diabetic group(DG)、small dose metfor

5、min group(SM,intragastric administration with metformin 100mg/kg·d）and large dose metformin group(LM, intragastric administration with metformin 300mg/kg.d ).All groups was taken blood sample to detecte insulin 、blood fat and free fatty acids and prepared myocardium homogenate to detecte activi

6、ty of superoxide dismutate (SOD) and malondialdehyde(MDA) and analyze the express of NF-B p65 and COX-2 in myocardium by immunohistochemical analysis,observe myocardial ultrastructure at the end of 12 weeks. Results  1)compared with the control group,body weight decreased significantly and bloo

7、d glucose 、heart index 、insulin、cholesterol、triglyeride and free fatty acids in DG group increased significantly（P0.01）. Compared with DG group, the level of insulin , heart index 、blood glucose、triglyeride and free fatty acids were cut down significantly after treatment with large or small dose met

8、formin（P0.01）.MDA increased and SOD deceased in myocardium tissues of diabetic group and the difference had significant difference compared with the control group（P0.01）. 2)Myocardial ultrastructure was normal in the control group,myoneme arranged disordered,the structure of typical sarcomere disapp

9、eared, mitochondrium intumesced,interstitial substance fiber hyperplasy,capillary vessel endothelial cell swelled in DG group.Myocardial ultrastructure improved slightly in rats of SM and LM groups. 3)NF-B p65 and COX-2 had a small quantity to present in the myocardium tissue of control group,while

10、the quantity increased obviously in the diabetic group.The level of it in the group of treatment was significant lower than that in the diabetic group.There was significant difference between the two groups. Conclusion  Metformin can protect against the heart injury in diabetic.The mechanisms m

11、ay be associated with inhibition of lipid peroxidation which can decreased the secretion of NF-B and COX-2 evoked by oxidative stress.Key words： metformin；diabetes mellitus；myocardium；anti-oxidative stress    在糖尿病(DM)的諸多慢性并發癥中，糖尿病性心肌病的危害最大，但由于其病因復雜，臨床診斷及治療困難，目前尚無治療該病的特效藥物。二甲雙胍(Metform

12、in，MT)是較傳統的降糖藥，近年由于其在心血管方面的突出作用，對此藥的研究日趨深入，特別是對其潛在非降糖機制的研究頗多1-2。本研究以高脂高糖喂養加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立的2型糖尿病動物模型為研究對象，觀察MT對心肌在抗氧化方面的作用。1  材料與方法1.1  材料清潔級近交系Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠45只(由寧夏醫學院實驗動物中心提供)，8周齡，體重為(220±20)g，實驗動物許可證號：SCXK(寧)2005-0001。鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司；二甲雙胍為天津中新藥業股份公司生產；兔抗鼠NF-B p65及CO

13、X-2多克隆抗體購自武漢博士德公司；MDA、SOD、FFA試劑盒為南京建成生物工程研究所的產品；血漿胰島素ElASA試劑盒購自大連泛邦試劑公司；微量血糖儀由羅氏公司提供；透射電鏡型號為HITACHI H-600。1.2  方法對照組10只大鼠飼以常規飼料，實驗組35只飼以高脂高糖飼料(10%豬油、20%蔗糖、2%蛋黃粉、1%膽鹽、67%常規飼料)。喂養6周后，實驗組大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈脲佐菌素35mg/kg(以pH4.5、0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液配制成20g/L溶液)；對照組僅注射等容積的枸櫞酸緩沖液，注射1周后，監測大鼠尾尖血糖，以血糖11.1mmol/L作為糖尿病成模標準

14、，按以上標準剔除未成模鼠4只，成模率為88.6%，將成模糖尿病大鼠隨機分為三組：單純糖尿病組10只、小劑量MT干預組11只(SM組)及大劑量MT干預組10只(LM組)。SM及LM組分別予二甲雙胍100mg/(kg·d)及300mg/(kg·d)溶于1mL生理鹽水灌胃治療，對照組及單純糖尿病組予以等容積生理鹽水灌胃，每日1次；所有大鼠分籠喂養，充分供給食水，每周測1次尿糖和體重，每月測1次血糖，成模后共觀察12周。于灌胃后12周時進行標本收集，先測尾尖空腹微量血糖，然后用20%烏拉坦溶液按5mL/kg腹腔注射麻醉，剖開胸腹，心內采血，迅速取出心臟，冰鹽水沖洗，濾紙吸干，稱量心

15、臟重量，計算心臟質量指數(心重mg/體重g)。(1)分離血清按試劑盒說明分別檢測INS、TG、T-CH及FFA；(2)制備心肌勻漿檢測：心肌組織SOD、 MDA(按說明書嚴格操作)，計算抗氧化比值AOR=SOD/MDA；(3)心肌電鏡觀察：于左心室前壁取1mm3心肌組織經戊二醛及鋨酸雙固定，梯度乙醇系列脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片觀察超微結構變化；(4)NF-B p65及COX-2的免疫組化染色(SABC法)：嚴格按說明書操作，NF-B p65為胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色片狀或顆粒狀染色為陽性結果，COX-2為細胞胞漿或間質著色為陽性，在image pro-plus 6.0病理圖像分析系統下，

16、測定陽性區域的面積及平均光密度，計算累積光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度。1.3  統計學方法 計量數據以均數±標準差(x±s)表示，多組間均數比較采用方差分析，所有數據用SPSS 11.5統計軟件處理。2  結果2.1  各組大鼠一般情況比較    對照組組大鼠精神狀態良好，毛色白有光澤，無死亡；單純糖尿病組大鼠均出現多飲、多食和消瘦等癥狀，且精神萎靡，毛色干枯；實驗結束時，單純糖尿病組死亡2只，血糖恢復正常1只；SM組死亡2只，LM組死亡1只。2.2  各組大鼠檢測指標的比較(表1)表1  各組大鼠檢測指標的比較(略)    與對照組比較，單純糖尿病組及SM、LM組體