1、    Alzheimer病患者海馬神經元核仁組成的研究        摘要目的間接了解Alzheimer's病(AD)海馬神經元總體基因表達水平。方法10例AD患者病理腦海馬組織經Nissl's染色后，像分析神經元核仁、核漿比值，核仁組成區銀染色后像分析神經元著色面積及積分吸光度，并與相應的正常青年組、老年組各10例的海馬標本進行比較對照。結果結論Nissl's染色說明老年人和AD患者海馬神經元功能低下，核仁組成區銀染色提示老年人和AD患者神經元rD

2、NA轉錄活性低下，但AD患者海馬神經元轉錄活性相對增高，其細胞總體基因表達活性相對增強，此種細胞形態學上的變化可能代表了細胞的一種防御系統。關鍵詞Alzheimer病核仁組成區基因 Investigation of the Nucleolar Organizer Regions in the Hippocampal Neurons of Alzheimer's DiseaseLu Wenfu, Tang Hongchuan, Fan Ming,et alDepartment of Neurology,The General Hospital of PLA (Beijing 100853

3、)AbstractObjectiveTo determine indirectly the degree of total gene expression in the hippocampal neurons of Alzheimer's disease (AD).MethodsNeuropathological examination was carried out in 10 cases of AD and control groups,including the Yang and elderly patients without any neurological disorder

4、.The nucleoli-nucleoplasm ration,stained area and intergral optical density of silver-stained nucleolar orgnizer regions (NORS) in the hippocampal neurons studied by image analysis after Nissl's and silver-stainings.ResultsThe nucleoli-nucleoplasm rations of hippocampal neurons were decreased in

5、 both of AD and elderly groups,in comparision with young group,with significant difference statistically (P<0.05 and P<0.01 respectively).There was no significant difference between the AD and elderly group (P>0.05) The stained area and intergral optical density in hippocampal neurons were

6、also reduced in the AD and elderly groups as compared with young group.But the stained area and intergral optical density of hippocampal neurons were increased more significantly in the AD group than that in the elderly group (P<0.05).ConclusionsThe results of nucleoli-nucleoplasm rations indicat

7、ed that the hippocampal neuron functions in the AD and elder were declined because of degenerative process of neurons.The results of silver-stained NoRs suggested that more active translating activity of rDNA in the AD hippocampal neurons might represent the cell defence function although the transl

8、ating activity was diminished in the AD and elderly groups.Key wordsAlzheimer diseaseNucleolar organizer regionsGeneAlzheimer病(AD)是發生在中年或老年期的一種進行性和不可逆性神經性變性疾病，臨床上以進行性癡呆為主要表現，常伴以精神行為異常而缺乏局灶定位體征，其確診主要靠尸檢。近年來，越來越多的資料提示，基因異?？赡芎虯D發病有關。核仁組成區(nucleolar organizer regions;NORs)是染色體上含有核糖體核糖核酸(ribosome ribonuc

9、leic acid;rRNA)基因的區段，通過銀染色方法，NORs的染色體蛋白被不同程度的染色1。銀染色的能力與核糖體基因轉錄狀態有相應的關系2，3。為此，我們對AD患者海馬神經元NORs進行研究，以了解核仁組成區的活性，即細胞總體基因表達的活躍程度。1對象和方法1.1模型與分組病理腦海馬組織10例AD患者(男7例，女3例)嚴格按AD臨床診斷標準進行篩選，生前無任何神經疾患，其臨床診斷進一步由病理所證實，即相應的年齡組內在海馬、顳葉、額葉皮層內出現大量的老年斑及神經元纖維纏結，并和相應的正常青年組、老年組海馬標本各10例進行比較、對照分析(表1)。表1AD和青年、老年患者年齡比較分組例數

10、77;st值P值青年組1030.8±7.8老年組1078.1±8.113.7<0.001*AD組1076.8±9.811.40.373<0.001*>0.05*青年組與老年組，*青年組與AD組，*老年組與AD組結果表明：老年和AD患者海馬神經元功能狀態低下或功能紊亂，可能反應了神經元的退變。1.2技術方法(1)HE染色。(2)銀染色(Bodian)染色。(3)尼氏染色(甲苯胺藍法)。(4)核仁銀染：將厚10um的海馬組織石蠟切片脫水、水化，將明膠溶于1%甲酸內配成2%溶液，將此溶液按12容積與5%硝酸銀溶液混合制成銀NORs染色工作液，將此工作液

11、滴于切片下，在20室溫下避光反應30分鐘以上，然后用去離子水沖洗、脫水、透明、封固。(5)像分析：將制備好的玻片置于Leits顯微鏡下，用高靈敏硒化鎘攝像裝置將組織景象投身到Quantime像分析儀(英國劍橋公司)的分析熒光屏上，以指令輸入器選擇指令并共同調節顯微鏡光照度及焦距，設定檢測閾，保證灰度分離，經2D轉換后進行測定，每張切片隨機挑選812個神經元進行測量，至少測量來自每組分的3個不同組織塊的切片。結果以機載Quips軟件分析處理。測量平均值表示為±s，并對青年、老年和AD三個組的測量結果進行t檢測分析。2結果2.1尼氏染色神經元核漿比值的變化腦海馬組織切片經尼氏染色后，神經

12、元呈淡藍色，細胞核呈深藍色，分析核漿比值的變化可以了解細胞的功能狀態(表2)。表2尼氏染色三組患者神經元核漿比值分組細胞數±st值P值青年組6060.8±5.9老年組6054.1±8.12.538<0.05*AD組6052.8±9.72.6371.976<0.01*>0.05*青年組與老年組，*青年組與AD組，*老年組與AD組2.2核仁銀染、細胞總體基因的表達核仁組成區銀染后，銀與NORs的染色體蛋白結合后成為深棕色小顆粒位于細胞核內，細胞核心呈淡黃色，此方法可顯示細胞內rDNA的轉錄活性，一般認為可反映細胞總體基因表達的活躍程度(表3

13、，4)。表3核仁銀染三組患者神經元核仁著色面積(m2)分組細胞數±st值P值青年組9723.82±7.04老年組7218.06±6.614.6529<0.01*AD組8121.17±5.482.352.26<0.05*青年組與老年組，*青年組與AD組，*老年組與AD組(下表相同)表4核仁銀染三組患者神經元核仁著色的積分吸光度分組細胞數±st值P值青年組97199.79±102.96老年組72141.43±54.992.67<0.01*AD組81173.24±42.812.0392.12<0.

14、05*結果表明：和青年組相比，老年組和AD組海馬神經元核仁著色面積減少，核仁的積分吸光度減弱。但老年組和AD組相比，AD患者海馬神經元核仁著色面積相對擴大，核仁積分吸光度相對增強，進一步提示AD時rDNA轉錄活性區在一定程度上相對擴大，其轉錄增強。 3討論AD的主要病理組織學表現為腦內出現神經元纖維纏結、老年斑、神經細胞顆?？张葑冃院虷irrano小體，其中以老年斑和神經元纖維纏結最具有診斷意義，上述改變亦可見健康的老年組，但其數量不同。本組10例AD患者病程最短者3年，最長者9年，除結合臨床表現外并經Bodian染色符合病理診斷標準而確診4，5。對照組青年組、老年組各10例均死于內科疾患，生

15、前無任何神經和精神疾患之表現和體征。腦海馬切片經尼氏染色后神經元呈淡藍色，細胞核呈深藍色，尼氏體在神經細胞內呈大塊或呈顆粒狀。近年來用紫外顯微分光光度計測量結果證明，尼氏體的吸收光譜與RNA是一致的。在電鏡下尼氏體是一些游離的核糖體和粗面內質網，它和神經細胞的功能具有密切的關系，分析核漿比值的變化可以了解神經細胞的功能狀態，本組像分析的結果說明老年和AD患者海馬神經元功能狀態低下的病理基礎。進一步說明老年人和AD患者隨年齡增長和病程延長，而逐漸出現細胞活性減低、功能減退，其病理基礎為細胞的老化、皺縮、退變、最終則發生細胞的死亡。核仁組成區(NORs)是染色體上含有rRNA基因的區段。這些基因在

16、RNA聚合酶I的參與下轉錄成rRNA前體，它們進而被加工成rRNA6，而核仁為在細胞間期內由于NORs中基因活動而形成的可見結構?，F已證實，采用膠銀染色技術顯示的嗜銀物質不是NORs本身，而是銀與NORs相關的酸性蛋白質結合，這些蛋白質即是核仁組成區相關AgNORs，這種結合具有高度的特異性。特殊銀染色技術可使具有轉錄活性的或已轉錄仍具轉錄活性的rDNA著色，沒有轉錄活性的不著色7，8。故AgNORs是細胞rDNA及其轉錄水平的一種良好細胞化學標志，AgNORs的數目可反映細胞核和細胞的活性，其面積可反映細胞總體基因的轉錄活性。我們利用這一方法對青年組、老年組和AD組海馬神經元進行了檢查。像分

17、析結果說明，和青年組相比，老年組和AD組核仁著色面積減少，積分吸光度減低，提示老年組和AD組海馬神經元rDNA轉錄活性低于青年組。Spencer9及Lezhava10在周圍血所培養的淋巴細胞曾觀察到此種現象。核糖體基因活性的減少可能是由于rDNA基因在調節和表達方面的變化而引起蛋白質合成的減少。但有趣的是老年組和AD組比較，其核仁著色面積相對擴大，積分吸光密度相對增強，提示AD患者海馬神經元轉錄活性相對增高，其細胞總體基因表達活性相對增強，有些作者在AD患者腦皮層觀察到一些形態學的變化，和對照組比較：神經元樹突脊在數量上增多，大小上增加；膽堿能纖維則延長曲張，提示此調節代償現象在人類可能比較發

18、達，因此，海馬神經元基因表達活性增強可能代表了一種細胞的防御系統?？傊?，AD神經元這些形態學上的變化可能是由于海馬神經元的患病階段或由于病理過程中仍然存活而沒有影響的神經元的代償機制所致。作者單位：盧文甫王魯寧（解放軍總醫院腦系科100853）范明米瑞發（軍事醫學科學院基礎所）參考文獻1Howel WM,Black DA.Controlled silver-staining of neucleolus organizers refions with a protective colloidal developer a 1-step method.Experimentia,1980,36:101

19、42Hubbell HR.Silver stianing as an indicator of active ribosomal genes.Stain Technol,1985,60:2853Jimenez R,Burgos M,Guardia RD.A study of the Ag-staining significance in mitotic NOR's.Heredity,1988,60:1254Mckhann G,Drachmann D,Folstein M et al.Clinical diagnosis of Alzheimer's disease:Report

20、 of the MINCDS-ADRDA work group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease.Neurology,1984,34:9395Richard L D,David MR.Textbook of Neuropathology In:Degenerative diseases of the central nervous system,Pathologic diagnosis of Alzheimer's disease,second.Baltimore.Hong Kong.London.Munich San Francisco.Sydney.Tokyo:Williams and Willins,1991,904-9186Crocker J and Nar P.Nucleolar organizer regions in lymphomas.J