1、2013-11-26實時熒光定量實時熒光定量PCR技術技術的原理及應用的原理及應用（Real Time Quantitative PCR） Contents一、實時一、實時熒光定量熒光定量PCRPCR的定義的定義二、二、RT-PCRRT-PCR技術的技術的原理及試驗流程原理及試驗流程三、三、RT-PCRRT-PCR技術的數據分析技術的數據分析四、四、RT-PCRRT-PCR技術的應用技術的應用實時熒光定量實時熒光定量PCR目錄目錄PCR電泳實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義普通PCR在在PCRPCR結束后對結束后對 進行定量分析進行定量分析終點產物終點產物 PCRPCR技術技術和和熒光

2、檢測技術熒光檢測技術的結合的結合通過通過熒光染料熒光染料或或熒光標記的特異性探針熒光標記的特異性探針，對，對PCRPCR產物進行產物進行標記跟蹤，標記跟蹤，實時在線監控實時在線監控反應過程反應過程，通過儀器和相應的，通過儀器和相應的軟軟件件分析結果分析結果，對待，對待測樣品的測樣品的初始模板進行定量初始模板進行定量或定性分析或定性分析。 克服了普通克服了普通PCRPCR：1 1、終點定量重復性不好、終點定量重復性不好 2 2、EBEB有毒，熒光太貴等缺點有毒，熒光太貴等缺點實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義PCRPCR技術技術和和熒光檢測技術熒光檢測技術的結合的結合通過通過熒光染料熒光

3、染料或或熒光標記的特異性探針熒光標記的特異性探針，對，對PCRPCR產物進行產物進行標記跟蹤，標記跟蹤，實時在線監控實時在線監控反應過程反應過程，通過儀器和相應的，通過儀器和相應的軟軟件件分析結果分析結果，對待，對待測樣品的測樣品的初始模板進行定量初始模板進行定量或定性分析或定性分析。實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義RT-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及試驗流程RT-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及試驗流程RT-PCR反應體系模板4.5lTag mixture5.0lF(F)0.25lR(R)0.25l熒光染料 SYBR Green I熒光標記的探針TaqMan探針法RT

4、-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及試驗流程Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）法）變性變性退火退火延伸延伸RT-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及試驗流程SYBR Green法優缺點法優缺點RT-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及試驗流程RT-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及試驗流程Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）法）RT-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及試驗流程TaqMan法法TaqMan探針法優缺點探針法優缺點RT-PCR技術的原理及試驗流程技術的原理及

5、試驗流程n絕對定量絕對定量(Absolute Quantification(Absolute Quantification，AQ)AQ) 病原體檢測 轉基因食品檢測 基因表達研究n相對定量相對定量(Relative Quantification(Relative Quantification，RQ)RQ) 基因在不同組織中的表達差異 藥物療效考核 耐藥性研究RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析相對定量通過內標定量相對定量通過內標定量內標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數量RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析內標內標（Endogenous ControlEndogenous Cont

6、rol）通常是18S、28S、-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數恒定，受環境因素影響小PCRPCR分四個階段分四個階段RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析-CtPCR擴增循環數扣除背景熒光后的相對熒光量1. 1. 熒光熒光域值（域值（thresholdthreshold）的）的設定設定在定量在定量PCRPCR中，需要經過數個循環后熒光信號才能夠中，需要經過數個循環后熒光信號才能夠被檢測到，一般以被檢測到，一般以1515個循環的熒光信號作為熒光本底個循環的熒光信號作為熒光本底信號。信號。RT-PCR技術的技術的數

7、據分析數據分析-CtPCR擴增循環數扣除背景熒光后的相對熒光量2. 2. Ct Ct 值的定義值的定義 在在熒光定量熒光定量PCRPCR技術中，有一個很重要的概念技術中，有一個很重要的概念 Ct Ct值。值。C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt值的含義是：值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數（如循環數（如圖所圖所示）。示）。RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析-Ct3. Ct3. Ct值與起始模板的關系值與起始模板的關系研究表明，每個模板的研究表明，每個模板

8、的CtCt值與該模板的起始拷貝數的對數存值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，在線性關系，起始拷貝數越多，CtCt值越小。利用已知起始拷貝值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代數，縱坐標代CtCt值。因此，只要獲得未知樣品的值。因此，只要獲得未知樣品的CtCt值，即可從值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。 PCR擴增循環數扣除背景熒光后的相對熒光量RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析3. Ct3. Ct值與起始模板的關系

9、值與起始模板的關系研究表明，每個模板的研究表明，每個模板的CtCt值與該模板的起始拷貝數的對數存值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，在線性關系，起始拷貝數越多，CtCt值越小。利用已知起始拷貝值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代數，縱坐標代CtCt值。因此，只要獲得未知樣品的值。因此，只要獲得未知樣品的CtCt值，即可從值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。 RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析相對定量分析方法相對定量

10、分析方法 -Ct前提:目標序列和內參序列的擴增效率接近100且偏差在 5以內 1、用目標基因的CT值減內參基因的CT值： CT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) CT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control) 2、用試驗樣本的CT值減校準樣本的CT值： CT= CT（test/control) - CT（calibrator) 3、計算表達水平比率： 相對表達量RQ= 2 CTRT-PCR技術的技術的數據分析數據分析SYBR Green 熔解曲線分析熔解曲線分析RT-PCR技術的技術的數據分析數據分析 臨床疾病診斷臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感等傳染病診斷和療效評價；腫瘤標志物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。 動物疾病檢測動物疾病檢測：禽