1、免疫學質量把握流程【目的】保證ELISA檢測結果精確可*, 充分發揮其方法學的優點。【該SOP變動程序】本標準操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報經下述人員批準簽字：專業主管、科主任。【方法】【分析前質控】1. 人員培訓試驗是人操作的，因此檢驗人員需經過培訓，嫻熟把握本專業如下幾方面的技術學問：1 檢驗項目的基本原理 （ELISA原理）；2 臨床意義；3 生疏檢測技巧，了解易出差錯的環節及難點；4 生疏檢測試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；5 生疏檢測儀器的原理及性能；把握數據處理的力量和質量把握學問。6 某些特殊項目的檢測如抗HIV等需經有關部門組織的特地培訓

2、班，考試合格后持證上崗。【試劑盒選擇】衛生部規定乙肝試劑，丙肝試劑，必需使用經衛生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產品。【試劑盒評價】試劑評價需要有權威的血清考核盤（Panel）進行檢測，價格昂貴，操作繁瑣，一般試驗室不易開展，可以通過以下信息，了解試劑質量。1.依據該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報告，了解其質量水平，依據質量方案選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；2.通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多肽），片段的組合（按比例混合或化學合成），片段的長短等推斷試劑的優劣；3.參考室間質評報告中對試劑的評價結果，了解不同試劑的質控成果。4.依據權威部門發布的試劑評價結果

3、，了解市場上試劑的質量優劣。【儀器質控】為使儀器保持最佳工作狀態應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要把握的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。1.移液器：ELISA加樣量小（5-100l），其精確性直接影響試驗結果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否精確，一般應在±10%以內；2.水浴箱：經常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內）實測溫度是否全都，允許有±1的誤差；3.洗板機：每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；4.酶標儀：經常維護其光

4、學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的精確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，精確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。一般的酶標儀在0.0002.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應留意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.0002.900，而其線性范圍僅0.0002.000，這在定量

5、ELISA中制作標準曲線時應予留意。【酶標儀校正程序】1.濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，用UV-2201型紫外-可見分光光度計（波長精度±0.3nm）于可見光區對每個濾光片進行掃描，其檢測值與標定值之差為濾光片波長精度。一般酶標儀無585nm濾光片，可選用550nm或630nm濾光片。450nm 濾光片的檢定選用普魯蘭溶液（校正波長為630nm）。2.通道差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯（杯底須光滑，透亮，無污染以酶標板架作載體，將其（內含200ul甲基橙溶液吸光度調至0.500A左右）置于8個通道的相應位置，蒸溜水調零，于490nm處連續測三次

6、,觀看其不同通道的檢測器測量結果的全都性，可用極差值來表示。孔間差的測量是選擇同一廠家，同一批號酶標2板條（8條共96孔）分別加入200ul甲基橙溶液（吸光度調至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水調零,于490nm處檢測，其誤差大小用±1.96s衡量。3. 零點飄移（穩定性觀看）：取8只小孔杯分別置于8個通道的相應位置，均加入200ul蒸餾水并調零，于490nm處每隔30分鐘測一次，觀看各個通道4小時內吸光度的變化。4.精密度評價：每個通道3只小杯分別加入200ul高中低3種不同濃度的甲基橙溶解，蒸餾水調零，于490nm作雙份平行測定，每日測二次（上下午各一次），連續測定20

7、天。分別計算其批內精密度，日內批精密度,日間精密度和總精密度及相應的CV值。5.線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制5個系列的溶液，于490nm平行測8次，取其均值。計算其回歸方程，相關系數及標準估量誤差s，并用±1.96s表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液（測定波長為490nm，校正波長為585nm），先后于8個通道檢測，每個通道測3次，比較各組之間是否具有統計學差異，以考察雙波長消退干擾組分的效果。【標本的采集和保存】1.標本采集時應盡量避開溶血，因紅細胞裂開可釋放過氧化物酶活性物質干擾立可讀方法的結果，以HRP為標記的ELI

8、SA測定中，溶血標本會增加非特異性顯色造成假陽性。2.長菌的標本同樣的道理也易產生假陽性，因菌體中可能含有內源性HRP也會產生假陽性反應。3.抗凝不完全的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。4.標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4冰箱5天內完成測試。如需保存一周以上則要-20冰凍保存，凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，融解時應上下顛倒充分混勻，同時避開氣泡。可上下顛倒混和，不要在混勻器上猛烈振蕩。反復凍融會使抗體效價跌落，如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。5. ELISA的靈敏度>1ng/

9、ml水平上,標本間的污染要盡量避開，尤其不應與生化試驗用同一管標本。【分析中質控】ELISA試驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數均應認真負責才能充分發揮ELISA的高靈敏，強特異的優點。因此,應建立試驗項目的標準操作程序(SOP)。1. 加樣1 加樣應用微量移液器（加樣槍）按規定的量加入微孔板底部，避開加在孔壁上部，不行濺出，不行產生氣泡。2 每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發生交*污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。3 樣本稀釋，目的是為了削減非特異性反應，所以肯定要先加稀釋液后加樣本，特殊留意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時留意防止液體溢出

10、。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。4 如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。2. 溫育1 抗原抗體反應需要在肯定溫度下（37°C），經過肯定的時間才能達到反應的平衡點2 ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般接受能使反應液溫度快速達到平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。3 反應板不宜疊放，留意溫育的溫度和時間應按規定把握，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。3. 洗滌1 手工洗滌一般接受浸泡方法：1）甩去孔內反應液； 2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；4）甩去孔內液體，拍板，

11、用紙吸干。重復以上操作至少5次。留意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。2 洗板機洗板肯定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能全都地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置肯定的浸泡時間。如消滅機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避開堵孔。4. 顯色1 HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要肯定的時間和溫度，2 肯定要依據說明書規定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止3 或依據臨界值質控血清吸光度值達0.2左右使的時間而恒定反應時間.5. 酶標儀判讀結果1.顯色反應終止后應馬上比色（30分鐘內）。2.常見的顯色系統

12、有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必需盡快比色以免影響結果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm。3.使用雙波長的優點可以消退反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要留意反應板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易消滅負值或損壞濾光片。【分析后質控】【報告方式】1.定性試驗：國內外為便于統一計算，一律按S/COV方式報告，S為標本A值，COV即Cut Off值（或COV）1 夾心法和間接法以S/COV1為陽性；競爭法與中和法以S/COV1為陽性2 COV的計算公式以試劑盒說明書的為準常見的

13、有：A） COV=2.1×N（當N不足0.05時按0.05計），此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。B） COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競爭，中和法。C） COV=N+C（C為常數），用于間接法。D) COV=C×P+N（C為常數），用于間接法。此公式最客觀，但對廠家要求很高，陰陽性對比測定值要基本恒定。2.定量分析：嚴禁用定性試劑盒做定量分析。1 用已知量的系列標準品，繪制標準曲線，結果以確定量或單位表示。ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。2 現有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內成直線，要

14、得到精確的結果實屬不易。【記錄】1 全部試驗的原始資料均應存檔；全部的記錄均應規范登記在冊；原始登記表應記錄試劑來源、批號；質控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上試驗者姓名及審核者姓名。2 如試驗結果對臨床診斷有打算意義，其樣本應保留，至少與病歷保存期全都【定性試驗】ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關，因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質控圖方法僅能觀看靈敏度而無法監控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試劑盒所設的陰陽性對比作為內對比指示反應；另設臨界值、高值質控血清，正常人血清作為外對比，與標本同時檢測，臨界值S/C.O1，高值質控血清S/C.O10，正常人血清A值在0.050.07之間。陽性質控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為"HOOK"效應監控）應重做陰性標本；陰性對比失控應重做陽性標本。以表格式記錄每塊板的外對比試驗結果，作為QC資料存檔。【定量試驗】ELISA定量試驗常見于腫瘤因子（如AFP，CEA，CA系列），激素類，免疫球蛋白類，這些物質在體內有肯定的量（正常范圍），超出這個量才呈病理狀