1、基因工程一、基因工程的概念基因工程是指依據人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賜予生物以新的遺傳特性，從而制造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的額，因此又叫做DNA重組技術?；蚬こ痰膭e名 基因拼接技術或DNA重組技術操作環境 生物體外操作對象 基因操作水平 DNA分子水平基本過程 剪切 拼接 導入 表達實質（原理） 基因重組結果改造的方向 克服遠緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳特性二、基因工程的基本工具1、限制性核酸內切酶-“分子手術

2、刀”2、DNA連接酶-“分子縫合針”3、基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”（5）識別序列的特點： 2“分子縫合針”DNA連接酶（1）作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成DNA分子。（2）類型相同點：都連接磷酸二酯鍵3“分子運輸車”載體(1)載體具備的條件：能在受體細胞中復制并穩定保存。具有一個至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。(2)最常用的載體是質粒，它是一種暴露的、結構簡潔的、獨立于細菌擬核之外，并具有自我復制力量的雙鏈環狀DNA分子。(3)其他載體：噬菌體的衍生物、動植物病毒。(4)載體的作用: 作為運載工具，將目的基因送入受體細胞。在

3、受體細胞內對目的基因進行大量復制?！窘忸}技巧】(1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。(2)限制酶的成分為蛋白質，其作用的發揮需要適宜的理化條件，高溫、強酸或強堿均易使之變性失活。(3)在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶，目的是產生相同的黏性末端。(4)獵取一個目的基因需限制酶剪切兩次，共產生4個黏性末端或平末端。(5)不同DNA分子用同一種限制酶切割產生的黏性末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位點應位于標記基因之外，不能破壞標記基因，以便于進行檢測。(7)基因工程中的載體與細胞膜上物質運輸的載體不同?；蚬こ讨械妮d體是DNA分子，能將

4、目的基因導入受體細胞內；膜載體是蛋白質，與細胞膜的通透性有關。(8)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。例1限制酶Mun和限制酶EcoR的識別序列及切割位點分別是CAATTG和GAATTC。如圖表示四種質粒和目的基因，其中，箭頭所指部位為限制酶的識別位點，質粒的陰影部分表示標記基因。適于作為圖示目的基因載體的質粒是（ ）A限制酶的應用特點（1）在獵取目的基因和切割載體時通常用同種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但是假如用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。（2）為了防止載體或目的基因的黏性末端自己連接，可用不同的限制酶分別處理目的基因

5、和載體，使目的基因兩側及載體上具有兩個不同的黏性末端五種酶的比較 作用底物作用部位形成產物限制性內切酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 黏性末端或平末端DNA連接酶 DNA片段 磷酸二酯鍵 重組DNA分子DNA聚合酶 脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵 子代DNADNA解旋酶DNA分子 堿基對間的氫鍵 脫氧核苷酸單鏈RNA聚合酶 核糖核苷酸 磷酸二酯鍵 核糖核苷酸單鏈三、基因工程的操作步驟1、目的基因的獵取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因

6、的檢測與鑒定1、目的基因的獵取獵取目的基因的方法：（1）直接分別法從基因文庫中獵取目的基因將含有某種生物不同基因的很多DNA短片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。包括基因組文庫和cDNA文庫。直接從基因組中獵取目的基因最常用的方法是： “鳥槍法”。（2）人工合成法化學合成法：片段較小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成儀用化學方法合成，不需要模板。反轉錄法：以RNA為模板，在逆轉錄酶作用下合成目的基因DNA（cDNA）。（4）利用PCR技術擴增目的基因PCR技術：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。由于PCR過程在高溫下進

7、行，因此需要使用熱穩定的DNA聚合酶。目的：通過指數式擴增獵取大量的目的基因前提：要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。2基因表達載體的構建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。(3)基因表達載體的構建過程：3將目的基因導入受體細胞目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為轉化。轉化的關鍵是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。金榜 P185轉化過程將目的基因插入到Ti質粒 的TDNA上農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞的染色體DNA上表達將含有目的基因的表達載體提純取卵(受精卵)顯

8、微注射受精卵發育獲得具有新性狀的動物Ca2處理細胞感受態細胞重組表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸取DNA分子4目的基因的檢測與鑒定誤區警示(1)標記基因的作用篩選、檢測目的基因是否導入受體細胞，常見的有抗生素抗性基因、發光基因(表達產物為帶顏色的物質)等。(2)受體細胞常用植物受精卵或體細胞(經組織培育)、動物受精卵(一般不用體細胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必需用真核生物酵母菌(需內質網、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，緣由是它營寄生生活；肯定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，緣由是它無細胞核，不能合成蛋白質。(3)基因表達載體中，啟動子(DNA

9、片段)起始密碼子(RNA)；終止子(DNA片段)終止密碼子(RNA)?；虮磉_載體的構建是最核心、最關鍵的一步，在體外進行。(4)目的基因與載體的連接方式有多種，如目的基因目的基因、目的基因載體、載體載體等。例3.下列有關基因工程操作的敘述中，正確的是 () AA用同種限制酶切割載體與目的基因可獲得相同的黏性末端B以蛋白質的氨基酸序列為依據合成的目的基因與原基因的堿基序列相同C檢測到受體細胞含有目的基因就標志著基因工程操作的成功D用含抗生素抗性基因的質粒作為載體是由于其抗性基因便于與外源基因連接例4 金榜P187 T2四、基因工程的應用與蛋白質工程1乳腺生物反應器與工程菌生產藥物的比較(1)含

10、義：乳腺生物反應器是指將外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產藥物蛋白。工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。(2)兩者區分：比較項目乳腺生物反應器工程菌基因結構動物基因的結構與人類基因的結構基本相同細菌或酵母菌等生物基因的結構與人類基因的結構有較大差異基因表達合成的藥物蛋白與自然蛋白質相同細菌細胞內沒有內質網、高爾基體等細胞器，產生的藥物蛋白可能沒有活性2蛋白質工程與基因工程的比較 （金榜P189）蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生

11、產和生活的需求。3、基因工程的應用： 金榜P1894、基因治療：（1）概念：指利用正常基因置換或彌補缺陷基因的治療方法。（2）方法：基因置換、基因修復、基因增補、基因失活等。如：腺苷酸脫氨酶（ADA）基因缺陷癥的基因治療。（3）基因治療的途徑體外基因治療：先從病人的體內獲得某種細胞進行培育，然后在體外完成基因轉移，再篩選成功轉移的細胞擴增培育，最終重新輸入患者體內。如腺苷酸脫氨酶基因的轉移。體內基因治療：用基因工程的方法，直接向人體組織細胞中轉移基因的治病方法。5、基因診斷（1）概念：又稱DNA診斷，是接受基因檢測的方法來推斷患者是否消滅了基因特別或攜帶病原體。（2）方法：DNA分子雜交技術。

12、它的基因原理是：互補的DNA單鏈能夠在肯定條件下結合成雙鏈，即能夠雜交，這種結合是特異的，即嚴格依據堿基互補配對的原則進行。當用一段已知基因的單鏈作探針（常用同位素、熒光分子等進行標記），與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，假如兩者的堿基完成配對，互補地結合成雙鏈，表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。誤區警示(1)基因治療后，缺陷基因沒有轉變?；蛑委熓前颜；驅胧荏w細胞中，以表達正常產物從而治療疾病，對原來細胞中存在缺陷的基因沒有清除或轉變。(2)對蛋白質分子進行改造，其本質是轉變其基因組成。假如對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白質分子還是無法遺傳。(3)DNA分子作探針進行檢測時應檢測單鏈，即將待測雙鏈DNA分子打開。(4)青霉素是青霉菌產生的，不是通過基因工程產生的。例5下列關于蛋白質工程和基因工