1、大腸桿菌及其檢驗(yàn)大腸桿菌的生物學(xué)特性· 簡介：大腸埃希氏菌習(xí)慣稱為大腸桿菌，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬，并且大腸桿菌株ATCC 11775是該屬的模式菌種。附：腸桿菌科各屬大腸桿菌的不同菌株間DNA相關(guān)性為80%，而與同科的志賀氏菌屬（除鮑氏志賀氏菌外）的DNA相關(guān)性可達(dá)80-87%。大腸桿菌為人和動(dòng)物腸道中的常居菌，一般多不致病，在一定條件下可引起腸道外感染。· 形態(tài)與染色大小0.40.7×13um,無芽胞,大多數(shù)菌株有動(dòng)力。有普通菌毛與性菌毛，有些菌株有多糖類包膜，革蘭氏陰性桿菌。附：有動(dòng)力是什么意思？請看動(dòng)力試驗(yàn)。革蘭氏陰性桿菌是什么意思？請看革蘭氏染

2、色介紹。大腸桿菌掃描電鏡照片大腸桿菌透射電鏡照片大腸桿菌分裂照片最新：大腸桿菌革蘭氏染色照片· 培養(yǎng)特性由于此菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46。在普通營養(yǎng)瓊脂上生長表現(xiàn)3種菌落形態(tài)：（1）光滑型： 菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中容易分散。（2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝。（3）粘液型：常為含有莢膜的菌株。此菌兼性厭氧，在有氧條件下生長良好，最適生長pH為6.8-8.0，所用培養(yǎng)基pH為7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于

3、8.0則生長緩慢。附：菌落形態(tài)有什么用處？菌落形態(tài)學(xué)生化反應(yīng)大部分菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并發(fā)酵葡萄糖、麥芽胞、甘露醇、木膠糖、阿拉伯膠等產(chǎn)酸產(chǎn)氣。IMViC試驗(yàn)為“+、+、-、-”。即為典型大腸桿菌。· 抗原構(gòu)造比較復(fù)雜，主要由菌體O抗原、鞭毛H抗原、夾膜K抗原組成。· 抵抗力該菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55經(jīng)60分鐘或60加熱15分鐘仍有部分細(xì)菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。對磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感，但易耐藥，是由帶有R因子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而獲得的。致瀉性大腸桿菌簡介大腸桿菌為人和動(dòng)物腸道中的常居菌，一般多不致病，在一定條件下可引

4、起腸道外感染。某些血清型菌株的致病性強(qiáng)，引起腹瀉，與人類疾病有關(guān)的大腸桿菌，統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌（enterovirulentE. coli ）。一般包括四種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）致病性大腸桿菌（EPEC）出血性大腸桿菌（EHEC）侵襲性大腸桿菌（EIEC）。（1）腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic E. coli,ETEC）：引起嬰幼兒和旅游者腹瀉，出現(xiàn)輕度水瀉，也可呈嚴(yán)重的霍亂樣癥狀。腹瀉常為自限性，一般23天即愈。營養(yǎng)不良者可達(dá)數(shù)周，也可反復(fù)發(fā)作。致病因素是LT或ST，或兩者同時(shí)致病。有些菌株具有定居因子，常見者為O6：K15：H16、O25：K7：H42。鑒定ET

5、EC主要測定大腸桿菌腸毒素，血清型有一定參考意義。（2）腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E.coli,EPEC）:是嬰兒腹瀉的主要病原菌，有高度傳染性，嚴(yán)重者可致死；成人少見。細(xì)菌侵入腸道后，主要在十二指腸、空腸和回腸上段大量繁殖。切片標(biāo)本中可見細(xì)菌粘附于絨毛，導(dǎo)致刷狀緣破壞、絨毛萎縮、上皮細(xì)胞排列紊亂和功能受損，造成嚴(yán)重腹瀉。EPEC不產(chǎn)生LT或ST。有人報(bào)道，EPEC可產(chǎn)生一種由噬菌體編碼的腸毒素，因?qū)ero細(xì)胞（綠猴腎傳代細(xì)胞）有毒性，故稱VT毒素。VT毒素的結(jié)構(gòu)、作用與志賀氏毒素相似，具有神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素和腸毒素性。鑒定EPEC可根據(jù)臨床表現(xiàn)與血清型。(3)腸侵

6、襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E.coli,EIEC）:EIEC的多數(shù)菌株無動(dòng)力，生化反應(yīng)和抗原結(jié)構(gòu)均近似痢疾桿菌，應(yīng)予注意。（4）腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）:引起散發(fā)性或暴發(fā)性出血性結(jié)腸炎，可產(chǎn)生志賀氏毒素樣細(xì)胞毒素。EHCO的主要菌型是O157：H7，還可有O26、O等。附：腸出血性大腸桿菌O157:H7介紹。此外，腸粘附性大腸桿菌（Enteroadhesive E.coli,EAEC）也可引起腹瀉，但對其發(fā)病機(jī)理與血清型尚不了解。EAEC不侵入腸上皮細(xì)胞，不產(chǎn)生LT或ST，也無VT毒素。唯一特征是具有與Hep-2細(xì)胞（人喉

7、上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系）粘附的能力，故也稱Hep-2細(xì)胞粘附性大腸桿菌。表：引起急性腹瀉的大腸桿菌腸產(chǎn)毒性大腸桿菌 腸致病性大腸桿菌 腸侵襲性大腸桿菌 腸出血性大腸桿菌 感染部位 小腸 小腸 大腸 大腸 腹瀉類型 水瀉 水瀉 痢疾樣 血性腹瀉 易感人群 嬰兒，成人 嬰兒 成人，兒童 各種年齡 分布 發(fā)展中國家(熱帶) 世界各地 世界各地 北美、日本 流行病學(xué) 散發(fā)或暴發(fā)嬰兒腹瀉及旅游者腹瀉 散發(fā)或暴發(fā)嬰兒腹瀉 散發(fā)或暴發(fā)，常見于年齡較大兒童 起散發(fā)性或暴發(fā)性出血性結(jié)腸炎致病機(jī)理 LT、ST定居因子 細(xì)胞毒素定居因子 侵襲腸粘膜細(xì)胞 細(xì)胞毒素 常見O血清型 6、8、15、20、25、27、78、148

8、、159 2、26、44、55、86、111、114、119、125、126、127、128、142、146、158 28、29、112、124、136、143、144、152、164、167 O157：H7 鑒定 測定LT、ST、檢出定居因子血清型 血清型與臨床表現(xiàn) 血清型測定細(xì)菌侵襲力 血清型 大腸桿菌的檢驗(yàn)方法 SN 016992出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法GB/T 4789.61994食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn) 以SN標(biāo)準(zhǔn)方法為例，進(jìn)行說明。樣品制備：以無菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi),于8000 r/min均

9、質(zhì)12min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。稀釋樣品勻液根據(jù)對樣品污染情況的估計(jì),用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10*-2、10*-3、10*-4。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。附：這是一種9管MPN法測定方法，什么是MPN法？LST和EC初步篩選：對每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。將接種管置于36±1培養(yǎng)48±2h。觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣

10、的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5±0.5水浴箱內(nèi),培養(yǎng)48±2h。附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？EMB平板：取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)(EMB)平板,36±1培養(yǎng)24±2h。檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。如有典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落；如無典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1培養(yǎng)1824h。附：怎樣進(jìn)行平板劃線分離？平板劃線示例EMB平板原理及照片生化試驗(yàn)：將斜面培養(yǎng)物

11、移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。1色氨酸肉湯：在36±1培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.20.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。附：靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片2 MR-VP培養(yǎng)基：在36±1培養(yǎng)48±2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1 mL至13mm×100mm試管中,加5-萘酚乙醇溶液0.6mL,40氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗(yàn)陽性。將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽性,若變黃色則為陰性反應(yīng)。附：MR-VP試驗(yàn)原理及照片3 Kos

12、er氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1培養(yǎng)96h記錄有無生長。附：枸椽酸鹽利用試驗(yàn)原理及斜面顯色照片4 LST肉湯：于36±1培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。5革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：靛 基 質(zhì) MR VP 枸椽酸鹽 鑒定(型別) 典型大腸桿菌 非典型大腸桿菌 典型中間型 非典型中間型 典型產(chǎn)氣腸桿菌 非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應(yīng)重新劃線分離,必要時(shí)做重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果報(bào)告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC試驗(yàn)為或,再根據(jù)

13、LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表,報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值。致瀉性大腸桿菌的檢驗(yàn)（GB方法簡介）增菌以無菌手續(xù)稱取檢驗(yàn)25g，加在225mL營養(yǎng)肉湯中，以均質(zhì)器打碎1min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養(yǎng)基，以測定大腸菌群MPN，其余的移入500mL廣口瓶內(nèi)，于36±1培養(yǎng)6h。挑取1環(huán)，接種于1管30mL腸道菌增菌肉湯內(nèi)，于42培養(yǎng)18h。分離將乳糖發(fā)酵陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板；污染嚴(yán)重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)平板，于36±1培養(yǎng)1824h，觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也

14、要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。附：麥康凱瓊脂平板照片EMB平板原理及照片生化試驗(yàn):自鑒別平板上直接挑取數(shù)個(gè)菌落分別接種三糖鐵瓊脂(TSI)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、pH7.2尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36培養(yǎng)過夜。TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希氏菌。TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN、尿素有任一項(xiàng)為陽性的培養(yǎng)物，均非大腸埃希氏菌。必要時(shí)做氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。附：三糖鐵瓊脂(TSI)原理及照片克氏雙糖鐵瓊脂照片尿素酶試驗(yàn)原理及照片半固體培養(yǎng)基的作用？血清學(xué)試驗(yàn)

15、假定試驗(yàn)：挑取經(jīng)生化試驗(yàn)證實(shí)為大腸埃希氏菌的瓊脂培養(yǎng)物，用致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌和產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌多價(jià)O血清和出血性大腸埃希氏菌O157血清做玻片凝集試驗(yàn)。當(dāng)與某一種多價(jià)O血清凝集時(shí)，再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)O血清做試驗(yàn)。如與某一個(gè)單價(jià)O血清呈現(xiàn)強(qiáng)凝集反應(yīng)，即為假定試驗(yàn)陽性。證實(shí)試驗(yàn)：制備O抗原懸液，稀釋至與Mac Farland3號比濁管相當(dāng)?shù)臐舛取Ｔr(jià)為1：1601：320的O血清，用0.5%鹽水稀釋至1：40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管內(nèi)等量混合，做單管凝集試驗(yàn)。混勻后放于50水浴箱內(nèi)，經(jīng)16h后觀察結(jié)果。如出現(xiàn)凝集，可證實(shí)為該O抗原。附

16、：致瀉性大腸桿菌及O血清。腸毒素試驗(yàn)（產(chǎn)毒素性大腸桿菌）（LT不耐熱腸毒素，ST耐熱腸毒素）1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測LT和ST。2雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測LT3乳鼠罐胃試驗(yàn)檢測ST附：腸毒素試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、腸毒素試驗(yàn)作出報(bào)告。 大腸桿菌 O157:H7的檢驗(yàn)出血性大腸桿菌O157:H7介紹 1、培養(yǎng)基制備：改良EC新生霉素增菌肉湯 （mEC）：EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過濾除菌的新生霉素，使終濃度為20g/mL。 改良山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）：山梨醇麥康凱瓊脂加入過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，使終濃度2.5mg/L，頭孢克污，使終濃度為0.05mg/L。MUG

17、-LST肉湯：LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使終濃度為0.1g/L。2、增菌培養(yǎng)秤取25克樣品放入225mL mEC中，均質(zhì)。于41±1培養(yǎng)18-24小時(shí)。3、分離將mEC肉湯培養(yǎng)物10倍遞增稀釋。從10-4，10-5，10-6稀釋度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1培養(yǎng)1824小時(shí)。可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心，直徑約2mm。附：在梅里埃公司改良山梨醇麥康凱瓊脂上的菌落。4、鑒定挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接種MUG-LST，于36±1培養(yǎng)1824小時(shí)，出現(xiàn)產(chǎn)氣，

18、且無熒光者，分離到普通營養(yǎng)瓊脂。對純菌落用EHEC O157:H7標(biāo)準(zhǔn)血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗(yàn)，必要時(shí)進(jìn)行生化試驗(yàn)。在檢測過程中，也可以在選擇性增菌后，取出5mL增菌液，經(jīng)100水浴15分鐘滅活后，供自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫測試（VIDAS），迅速獲得初步結(jié)果，陽性反應(yīng)者需作進(jìn)一步證實(shí)。附:自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫測試（mini-VIDAS）自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫測試（VIDAS）測定程序· EHEC O157:H7檢驗(yàn)程序圖解檢樣25gmEC225mL VIDAS快速篩選41±1，18-24h10-4，10-5，10-6稀釋度涂布TC-SMAC36±1，18-24h挑取5-10個(gè)

19、可疑菌落接種MUG-LST36±1，18-24hMUG陰性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種普通營養(yǎng)瓊脂生化反應(yīng)鑒定 血清凝集鑒定或膠乳凝集試驗(yàn)用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落，經(jīng)抗E.coli O157:H7標(biāo)準(zhǔn)血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽性者，報(bào)告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。如需要進(jìn)一步檢測Vero毒素基因的存在，可通過接種Vero細(xì)胞或Hela細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變進(jìn)行判定，或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測法。（參見FDA細(xì)菌分析手冊第8版）染色技術(shù) 由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的

20、明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和直接計(jì)算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意。本節(jié)包括四部分：一、染色的基本原理二、染料的種類和選擇三、制片和染色的基本程序 四、染色方法一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易

21、吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細(xì)胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，pH值大約在25之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。影響染色的其它因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的

22、通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。二、染料的種類和選擇染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分復(fù)雜，有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機(jī)酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機(jī)溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料、中性（復(fù)合）染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?、酸性染料這類染料電離后

23、染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時(shí)，細(xì)菌所帶的正電荷增加，這時(shí)選擇酸性染料，易被染色。2、堿性染料這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實(shí)驗(yàn)室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細(xì)菌易被堿性染料染色。3、中性（復(fù)合）染料酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復(fù)合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細(xì)胞核的染色。4、單純?nèi)玖线@類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于

24、被染物而定，因?yàn)樗鼈兇蠖鄶?shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。三、制片和染色的基本程序微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。1、制片在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團(tuán)，不利觀察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。2、自然干燥涂片最好在室溫下使其自然

25、干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。3、固定標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個(gè)：）殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。）改變?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過34次，共約23秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60）,放置待冷后，進(jìn)行染色。以上這種固定法在微生物實(shí)驗(yàn)室中雖然應(yīng)用較多普遍，但

26、是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法。化學(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，12%的餓酸等。餓酸能很快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的12%餓酸溶液，同時(shí)在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過12分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。4、染色標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時(shí)間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時(shí)染色時(shí)還要加熱。染料作用標(biāo)本的時(shí)間平均約13分鐘，而所有的染色時(shí)間內(nèi)，整個(gè)涂片（或有標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中。若

27、作復(fù)合染色，在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時(shí)進(jìn)行。、脫色用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色。可檢查染料與細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細(xì)菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。、復(fù)染脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進(jìn)行染色，就是復(fù)染。、水洗染色到一定的時(shí)候，用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。、干燥著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時(shí)，切勿使載玻片

28、翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。、鏡檢干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。綜上所述，染色的基本程序如下：制片固定媒染染色脫色復(fù)染水洗干燥鏡檢。四、染色方法微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗(yàn)中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。、單染色法用一種染色劑對涂片進(jìn)行染色，簡便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時(shí)，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性（低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個(gè)步驟。染色