1、用正交法測定幾種因素對酶活力的影響一、前言正交實驗法正交實驗法就是利用排列整齊的表-正交表來對試驗進行整體設計、綜合比較、統計分析，實現通過少數的實驗次數找到較好的生產條件，以達到最高生產工藝效果。正交表能夠在因素變化范圍內均衡抽樣，使每次試驗都具有較強的代表性，由于正交表具備均衡分散的特點，保證了全面實驗的某些要求，這些試驗往往能夠較好或更好的達到實驗的目的。正交實驗設計包括兩部分內容:第一，是怎樣安排實驗;第二，是怎樣分析實驗結果。酶活力酶活力（enzyme activity）也稱為酶活性，是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學反應的速度來表示，酶催化反

2、應速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反應的速度。酶促反應速度可用單位時間內、單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。在一般的酶促反應體系中，底物往往是過量的，測定初速度時，底物減少量占總量的極少部分，不易準確檢測，而產物則是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準確測定。二、實驗目的1.學習并掌握正交法應用原理。2.采用正交法測定多種因素對酶活力的影響。三、實驗原理酶促反應常常同時受到多種因素(包括激活劑和抑制劑等)的交互影響，可采用正交法進行綜合研究，即通過少量試驗收到更好的效果：多快好省。本實驗以正交法同時測定S、E、溫度和pH值對trypsin活性的影響，以求得

3、酶活最大時相應影響因素的最佳值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。四、實驗器材和試劑實驗器材：試管漏斗溫度計吸管恒溫水浴鍋分光光度計實驗試劑：2%血紅蛋白液(Hb)15%三氯醋酸液(TCA)trypsin酶液0.04mol/L巴比妥緩沖液(pH 7, 8, 9)考馬斯亮藍染液 五、實驗操作1.實驗設計本實驗為四因素三水平(總試驗次數34=81)，可選用L9正交表（僅需9次試驗)，展開后其特性為均衡搭配（1）每列中水平數1、2、3出現次數相同，均為3次；（2）每兩列的橫行數對(1-1/1-2/3-2/3-3)各出現一次。列號試驗號12341111121222313334212352231623

4、127313283213933212.將各因素及其相應水平參數依次填入得到實驗安排表 試驗號試劑/ml1682493572%血紅蛋白液0.20.50.80.20.50.80.20.50.8緩沖溶液pH72.6pH81.7pH91.7pH82.3pH92.3pH72.0pH92.0pH72.0pH82.037預溫5min50預溫5min60預溫5min酶液0.20.80.50.50.20.80.80.50.237反應10min50反應10min60反應10min（1）各試管編號，分別加入對應容量的底物(2% Hb)和相應pH值的緩沖液，混勻；（2）同溫處理的3支試管同時預溫5min；（3）各試管

5、依序分別加入對應容量的trypsin酶液(統一加樣時間間隔)，混勻；（4）同溫處理的3支試管置對應恒溫水浴中反應10min；（5）各試管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混勻以終止反應；（6）非酶促對照：另取一試管，先加入2%血紅蛋白液0.5ml及pH8緩沖液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混勻靜置10min后再加入酶液0.5ml；（7）上述各管反應液室溫靜置15min后過濾，取濾液待測酶活；（8）酶活測定(考馬斯亮藍法，標準曲線制備略)：取試管若干支編號，分別加入對應的樣品濾液1.0ml及考馬斯亮藍液4.0ml，混勻，室溫靜置3min，以非酶促對照管為空白，于波長595nm比色測定

6、。3.數據記錄及分析將各管測定所得光密度值對應填入表格，分別算出各因素一、二及三水平的試驗結果總和、和，并分別取其平均值計算相應的極差(各列中最大與最小值之差)；比較各因素極差的大小以評估各因素對酶活的影響，并對酶活最高時的各因素水平作一直觀分析。六、實驗結果及數據處理1.實驗數據： pH值溫度pH7pH8pH9測量值平均值測量值平均值測量值平均值370.0030.00230.0680.06670.1850.18400.0020.0660.1850.0020.0660.182500.0590.05600.0960.09670.0790.08100.0580.0970.0820.0510.097

7、0.082600.1400.14170.1630.16100.0650.06600.1410.1590.0640.1440.1610.0692.實驗數據處理分析：列號試驗號1S/ml2E/ml3溫度/（）4pH試驗結果A680nm1234567891 0.21 0.21 0.22 0.52 0.52 0.53 0.83 0.83 0.81 0.22 0.53 0.81 0.22 0.53 0.81 0.22 0.53 0.81 372 503 602 503 601 373 601 372 501 72 83 93 91 72 82 83 91 70.00230.05600.14170.096

8、70.16100.06670.06600.18400.0810（一水平試驗結果總和）（二水平試驗結果總和）（三水平試驗結果總和）0.20000.92470.33100.16500.40100.28940.25300.23370.36870.24430.18870.4224/3/3/30.06670.30820.11030.05500.13370.09650.08430.07790.12290.08140.06290.1408極差0.24150.07870.04500.0779由上述表格各因素極差大小可看出，底物濃度對于酶活力影響最大，其次是酶濃度，再次是pH，最后是溫度。根據上表數據，以吸光度

9、值（/3、/3、/3）為縱坐標，因素的水平數為橫坐標作圖圖一 底物濃度對酶活力的影響從圖一可看出，在一定濃度范圍內，隨著底物濃度的增大，酶活力是逐漸降低的，約在底物濃度為0.5mol/ml時酶活力達到最低。圖二 酶濃度對酶活力的影響從圖二可看出，在一定濃度范圍內，隨著酶濃度升高，酶活力是逐漸降低的，約在酶濃度為0.55mol/ml時酶活力達到最低。圖三 溫度對酶活力的影響從圖三可看出，在一定濃度范圍內，隨著溫度升高，反應速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在溫度為50時酶活力達到最高。圖四 pH對酶活力的影響從圖四可看出，在一定濃度范圍內，隨著pH升高，反應速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在pH為8時酶活力達到最高。七、實驗注意事項1.每加入一種試劑都需要充分混勻。2.應確保酶促反應的溫度及反應時間的準確性。八、思考題1.正交法有何優點？答：通過少數的實驗次數找到較好的生產條件，能夠在因素變化范圍內均衡抽樣，使每次試驗都具有較強的代表性，保證了全面實驗的某些要求，這些試驗往往能夠較好或更好的達到實驗的