1、高效液相色譜儀分析測試系統組成高效液相色譜儀的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相內,由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數,在兩相中作相對運動時,經過反復多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,數據以圖譜形式打印出來。工作原理分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關,也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中,K有不同的概念:吸附色譜法為吸附系數,離子交換色譜法

2、為選擇性系數(或稱交換系數,凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等一定,樣品濃度很低時(Cs、Cm很小時,K 只取決于組分的性質,而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件,在這種條件下,得到的色譜峰為正常峰;在許多情況下,隨著濃度的增大,K減小,這時色譜峰為拖尾峰;而有時隨著溶質濃度增大,K也增大,這時色譜峰為前延峰。因此,只有盡可能減少進樣量,使組分在柱內濃度降低,K恒定時,才能獲得正常峰。延伸在同一色譜條件下,樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長,后流出色譜柱;K值小的組分則滯留時間短,先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大,越容

3、易分離,因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。在HPLC中,固定相確定后,K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值,以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間,達到分離的目的。色譜(high performance liquid chromatography,HPLC也叫高壓液相色譜(high pressure liquid chromatography、高速液相色譜(high speed liquid chromatography、高分離度液相色譜(high resolution liquid chromatography等。是在經典液相色譜法的基礎上,

4、于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法,高效液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩;進樣系統要求進樣便利切換嚴密;由于液體流動相粘度遠遠高于氣體,為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗,長度也遠小于氣相色譜柱。HPLC應用非常廣泛,幾乎遍及定量定性分析的

5、各個領域。使用高效液相色譜時,液體待檢測物被注入色譜柱,通過壓力在固定相中移動,由于被測物種不同物質與固定相的相互作用不同,不同的物質順序離開色譜柱,通過檢測器得到不同的峰信號,最后通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法,廣泛的應用于化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別,它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相,適于分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。色譜特點高壓壓力可達150300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速流速為0.110.0mL/min。高效塔板數可達5

6、000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經典液相色譜相比有以下優點:速度快通常分析一個樣品在1530min,有些樣品甚至在5min內即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達0.01ng,熒光和電化學檢測器可達0.1pg。色譜柱可反復使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少,容易回收樣品經過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。主要類型液固吸附色譜1.1分離原理液固色譜是基于各組分吸附能力的差異進行混合物分離的,其固定相是固體吸附劑。1.2固定相;吸附色譜固定相可以分為極

7、性和非極性兩大類。1.3流動相;流動相要求:1.4應用液固色譜是以表面吸附性能力為依據的,所以它常用于分離極性不同低的化合物,也能分離那些具有相同極性基團,但數量不同的樣品。液液分配色譜1.1分離原理;分配色譜法的原理與液液萃取相同,都是分配定律。1.2固定相;分配色譜固定相由兩部分組成,一部分是惰性載體,另一部分是涂漬在惰性載體上的固定液。1.3流動相;分內色譜中,要求流動相盡可能不與固定液互溶1.4應用;既能分離極性化合物,又能分離非極性化合物。由于不同極性鍵合固定相的出現,分離的選擇性可得到很好的控制。鍵合相色譜1.2固定相;按極性大小可分為非極性、弱極性、極性化學鍵合固定相三種。凝膠色

8、譜凝膠色譜又稱分子排阻色譜,它是按照分子尺寸大小順序進行分離的一種色譜方法。凝膠色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料,有一定的形狀和穩定性。根據所用流動相的不同,凝膠色譜法可以分為兩類:即用水溶劑做流動相的凝膠過濾色譜法(GFC與用有機溶劑如四氫呋喃做流動相的凝膠滲透色譜法(GPC.應用高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液,不受樣品揮發性的限制,流動相可選擇的范圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩定和非揮發性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質。與試樣預處理技術相配合,HPLC所達到的高分辨率和高靈敏度,使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能,能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發展,有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離。HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用,流出組分易收集等優點,因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析