1、當歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后PTEN的表達及統計分析【摘要】 目的：探討當歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細胞PTEN的表達及統計學意義。方法:將35只SD大鼠隨機分成4組(n=10):正常對照組(n=5);假手術組(n=10);缺血再灌注組(n=10);當歸治療組(n=10) ,建立在體心肌缺血再灌注動物模型。實驗完畢后，將各組動物心肌組織做免疫組織化學染色;觀察各組動物心肌細胞內PTEN表達的變化。利用HPIAS2000圖像分析系統測定PTEN在以上各組中表達的平均光密度和平均陽性面積率。結果：正常對照組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;假手術組：心肌細胞內可見

2、少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細胞內可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達呈陽性;當歸治療組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性。圖像分析結果顯示：正常對照組、當歸治療組、 假手術組與缺血再灌注損傷組之間PTEN表達的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術組之間、當歸治療組與假手術組之間PTEN表達的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。結論：當歸注射液對大鼠缺血再灌注損傷導致心肌細胞的凋亡有重要的保護作用。 【關鍵詞】 當歸注射液; 缺血再灌注; 心肌;

3、 細胞凋亡; PTEN心肌缺血再灌注損傷( ischemia / reperfusion, I/R), 是指在短時間心肌血供中斷, 一定時間內恢復血供, 原缺血心肌發生較血供恢復前更嚴重的損傷。隨著心臟外科體外循環、冠狀動脈搭橋術、復雜先天性心臟病糾治術、及溶栓等治療的推廣應用, 已成為阻礙心血管治療療效的主要難題1。近年,中草藥在心肌缺血再灌注損傷中的作用受到越來越多的關注, 中草藥舒張冠狀血管、改善冠脈循環, 減輕氧化損傷等均是其發揮心臟保護作用的重要機制2。當歸為傘形科(Umbrelliferae)植物的干燥塊根,藥性甘、辛、溫,入肝、心、脾經, 具有補血活血、調經止痛、潤燥滑腸等功效3

4、，4。當歸屬于和血類藥物(指有養血、調和血脈作用的藥物) 。近年來，有不少學者對中藥預處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用進行了研究與探索。PTEN 基因是迄今為止發現的第一個具有雙特異性磷酸酶(DPS) 活性的抑癌基因,該基因在細胞的生長、增殖、遷移和細胞凋亡中具有重要的生物學功能5。本實驗采用免疫組織化學方法觀察當歸注射液對缺血/再灌注過程心肌細胞內PTEN的表達,探討當歸注射液對心肌缺血/再灌注損傷的作用機理。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動物模型制備及分組 選用健康雄性Wistar大鼠(SPF級)35只,體重250300g左右。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg·(100

5、g)-1,麻醉動物后行氣管切開接微型呼吸機人工呼吸呼吸頻率60 次·min-1, 潮氣量2ml·(100g)-1,沿胸骨左緣第4肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結扎/ 開放左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動物隨機分成4組: 正常對照組(不做任何處理);假手術組(絲線穿過冠狀動脈前降支但不結扎);缺血再灌注損傷組(IR)( 缺血/ 再灌注前靜脈注射生理鹽水0.8ml / kg，結扎左冠狀動脈前降支45min ,再灌注120 min );當歸注射液預處理組(在結扎前20min，靜脈注射當歸注射液0.8ml/ kg , 其它處理同缺血/ 再灌注組)。1.2 主要試

6、劑25%當歸注射液(武漢大學中南醫院制藥廠);即用型兔抗鼠Bim多克隆抗體，即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒，DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。以上試劑均購于北京中山生物技術有限公司。1.3 方法1.3.1 常規HE染色 取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色。1.3.2 免疫組織化學SP法檢測PTEN相關抗原 主要步驟：5m組織切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫處理10 min以抑制內源性過氧化物酶活性，Ki67均采用高壓抗原修復，正常羊血清處理10 min以減少非特異性背景，一抗4孵育過夜，生物素標記的二抗處理10 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物處理10min，DAB顯色液

7、顯色，自來水沖洗終止反應，蘇木精復染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組。1.4 免疫組織化學結果判斷PTEN以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統對PTEN抗原的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.5 統計學處理對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和q 檢驗，檢驗水準

8、為0.05。2 結果PTEN的表達 正常對照組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;假手術組：心肌細胞內可見少量棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細胞內可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達呈陽性;當歸治療組：心肌細胞內可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達呈陰性。圖像分析結果顯示：正常對照組：PTEN表達的平均光密度為0.1925±0.0011，假手術組：PTEN表達的平均光密度為0.2013±0.0024，缺血再灌注損傷組：PTEN表達的平均光密度為0.8974±0.0086;當歸治療組：PTEN表達的表達的平均光密度為

9、0.2183±0.0038;正常對照組：PTEN表達的陽性面積率為0.2038±0.0023，假手術組：PTEN表達的陽性面積率為0.2159±0.0026，缺血再灌注損傷組：PTEN表達的陽性面積率為0.9631±0.0077;當歸治療組：PTEN表達的表達的陽性面積率為0.2485±0.0048。經單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P<0.05)。經q 檢驗，正常對照組、當歸治療組、 假手術組與缺血再灌注損傷組之間PTEN的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術組之間

10、、當歸治療組與假手術組之間PTEN平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。表1 當歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后各組PTEN表達的平均光密度和陽性面積率注：* 正常對照組、假手術組、當歸治療組與缺血再灌注損傷組比較，P<0.001; 當歸治療組、假手術組與正常對照組比較，P>0.05。3 討論近年來,心血管疾病已成為威脅人類生命的主要原因,而心肌梗死的發病率亦呈上升趨勢。眾所周知,早期溶栓治療是心肌梗死較為理想的治療手段,它可以挽救缺血的心肌細胞,減少梗死面積,改善心臟功能。但溶栓造成的再灌注損傷也愈來愈引起臨床醫務工作者

11、的關注。長時間心肌缺血可造成組織損傷和細胞死亡,早期的再灌注可挽救缺血組織,但仍能造成細胞繼續死亡,這種再灌注給組織帶來的負性影響被稱為再灌注損傷6。動物實驗發現,于大鼠短暫缺血30min后進行觀察,未見凋亡細胞數量增多。而再灌注240min于缺血的左室壁,發現有大量的心肌細胞凋亡出現。證實存在再灌注心肌細胞的損傷,且在短暫缺血后再灌注心肌細胞死亡主要為細胞凋亡。提示心肌細胞凋亡是心肌再灌注損傷的特征之一,可能與再灌注心肌遲發性死亡密切相關7,8。當歸是傳統中藥,可對缺血心臟冠脈血管有明顯的擴張作用,促進心肌側枝循環的建立,改善心肌血流分布,減輕因缺血再灌注引起的細胞結構的改變。研究發現, 當

12、歸對細胞凋亡有防治作用。在再灌注前給藥,可明顯減少再灌注引起的細胞凋亡,并證明當歸對心肌缺血的保護點在再灌注期,這將當歸的研究提高到分子生物學水平9，10。PTEN 基因全長200 kb ,有9個外顯子,mRNA長度為5.5 kb ,cDNA 序列內有一個由1209 個核苷酸組成的開放閱讀框,編碼由403個氨基酸殘基組成蛋白。免疫熒光顯示,PTEN 蛋白定位于胞漿中,具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶活性,能使某些磷脂或蛋白激酶相應位點去磷酸化,抑制細胞周期的運行,介導細胞凋亡,并調控細胞的黏附、遷移和分化1113。PTEN 因其獨特的作用途徑而倍受關注,它作為第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因,具有抑制

13、生長、促進凋亡、參與細胞周期的調控、抑制血管生成及抑制細胞黏附和轉移的作用14，15。本實驗數據表明: 正常對照組：PTEN表達較低;假手術組：PTEN表達較低;缺血再灌注損傷組：PTEN表達高;當歸治療組：PTEN表達較低。圖像分析結果顯示：正常對照組、當歸治療組、 假手術組與缺血再灌注損傷組之間PTEN表達的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術組之間、當歸治療組與假手術組之間PTEN表達的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05) 。實驗結果提示: 心肌I/ R 損傷可誘發心肌細胞凋亡, 當歸能對缺血心臟冠脈

14、血管有明顯的擴張作用,促進心肌側枝循環的建立,改善心肌血流分布, 可明顯減少再灌注引起的細胞凋亡，對心肌細胞起了重要的保護作用。【參考文獻】 1 楊勇, 賈國良. 左旋卡尼汀對培養乳鼠心肌細胞模擬缺血再灌注損傷的保護作用.第四軍醫大學學報, 2004, 25 (2) : 134137.2 李貴榮,呂昌銀,楊勝圓. 當歸多糖清除活性氧自由基作用的研究. 南華大學學報, 2002,16(3):1820.3 陳江弘,楊崇仁.當歸屬植物的研究進展.天然產物研究與開發,2004 ,16 (4): 359365.4 李用珍,劉彩紅,董紅軍.當歸化學成分研究.實用中醫藥雜志,2004 ,20(2):1051

15、06.5 陳國庭, 尹浩然, 朱正剛. PTEN基因的研究進展. 國外醫學遺傳學分冊, 2001, 24: 7173.6 Ji ES ,Yue H ,Wu YM, et al . Effects of phytoestrogen genistein on myocardial ischemia/ reperfusion injury and apoptosis in rabbits. ActaPharmacol Sin, 2004, 25(3):306312.7 Ji ES ,Yue H ,Wu YM, et al . Effects of phytoestrogen genistein on

16、 myocardial ischemia/ reperfusion injury and apoptosis in rabbits. ActaPharmacol Sin, 2004, 25(3):306312.8 王雨. 缺血再灌注損傷與細胞凋亡. 中國普外基礎與臨床雜志,2002 ,9 (1) :6164.9 龍全江,徐茂保,趙海鷹. 當歸油炒前后揮發油化學成分對比研究.中國中藥雜志, 2007,31 (24) :20852087.10 張翠蘭,文德鑒.當歸對血液及造血系統藥理作用研究進展.湖北民族學院學報·醫學版,2002,19(4):3436.11 Weng L, B rown

17、 J, Eng C. PTEN induces apop tosis and cell cycle arrest through phosphoinositol3kinase / Akt dependent andindependent pathways. HumMol Genet,2001, 10(3):237242.12 Tamura M, Gu J, Matsumoto K, et al. Inhibition of cell migration, sp reading, and focal adhesions by tumor supp ressor PTEN. Science, 1998, 280 (5369):1614 1617.13 TanakaM, KoulD,DaviesMA, et al. MMAC 1 /PTEN inhibits cell growth and induces chemosensitivity to doxorubicin in human bladder cancer cells. Onco gene, 2000, 19 (47):54065412.14 Mutter GL, L in MC, Fitzgerald JT, et al. Altered PTEN expression as a diagnost