1、纖維素酶及其在生產燃料酒精中的應用摘 要:植物利用二氧化碳，通過光合作用產生的木質纖維是地球上最豐富、最廉價而又可再生的資源。木質纖維主要成分是纖維素和半纖維素，纖維素和半纖維素的利用一直是研究熱點課題。而纖維素酶能有效地將農作物秸桿等富含纖維素的物質水解為葡萄糖，最終經過發酵產生生物酒精。因此，尋找高效低價的纖維素酶，然后利用它來生產酒精，這對于解決人類文明發展的能源與環境問題具有化時代的意義，具有廣闊的發展前景。關鍵詞: 微生物;纖維素酶;燃料酒精；發展前景Celluase and its using on the Production of BioethanolAbstract:Lign

2、ocelluloses are the most abundant and cheapest sources of carbohydrate,continually replen-ished by photosynthetic reduction of carbon dioxide with sunlight energy, its composed by cellulose and hemicellulose. To date, how to make use of this resource is the hot topic for research.Cellulase enzymes c

3、an effectively hydrolyze cellulose to glucose in maize straw, which can produce ethanol for the energy after fermentation.Therefore, the search for efficient and low-cost cellulase,and then use it to produce alcohol,which has great significance and a broad development prospects in solving energy and

4、 environmental issues during the development of human civilization.Key words:microbe;cellulose,bioethanol; development prospect能源與環境問題制約著人類文明的發展。近幾年來，可持續再生的生物能源研究與應用取得了巨大的進展，其中生物酒精成為一種可替代石油、廉價環保的能源。目前生物酒精主要是采用淀粉為原料生產的，成本價是汽油的兩倍。為此，利用纖維素酶以富含纖維素的生物廢料為原料生產酒精的生產技術已經成為研究的熱點，全世界已有幾十套中試生產線或試生產線。其中，生產上的主要障礙

5、是酶解成本過高，占總生產成本的40%55%，只有在酶的成本降低至1/10，投資成本降低30%，利用纖維素酶生產出來的酒精才能與石油相競爭。因此，生產高效低價的纖維素酶對于其在生產酒精工業上的運用具有重要意義。1 纖維素酶的組成、結構及作用機制1.1纖維素酶的組成1.2纖維素酶的結構纖維素酶分子普遍具有類似的結構,由球狀纖維素催化結構、纖維素結合結構域和連接橋3部分組成2。纖維素酶中最大的功能區是催化區，它體現酶的催化活性及對特定水溶性底物的特異性。不同來源的纖維素酶分子大小差別很大，但它們的催化區的大小卻基本一致。纖維素酶的結合結構域主要維持酶分子的構象穩定性，調節酶對可溶性和非可溶性底物的結

6、 合專一性；連接橋可保持球狀纖維素催化結構和纖維素結合結構域之間的距離,有助于不同酶分子間形成較為穩定的聚集體。1.3纖維素酶的作用機制一般地，外切酶作用于不溶性纖維表面，使形成結晶結構的纖維素長分子鏈開裂，長鏈分子末端部分發生游離易于水化；內切酶則作用于經外切酶活化的纖維素，分其-1,4鍵，產生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖；而-葡萄糖苷酶再將纖維二糖、三糖等分解成葡萄糖，完成協同反應全過程2。當然協同作用順序不是絕對的，各酶的功能也不是這樣簡單、固定的。2 纖維素酶的來源及微生物產生纖維素酶的特點2.1 纖維素酶的來源纖維素酶的來源非常廣泛，原生動物、軟體動物、昆蟲和植物的一些組織等能產生纖維

7、素酶，絲狀真菌、細菌和放線菌等在一定條件下也能產生纖維素酶。微生物以外的生物生產纖維素酶缺乏大規模應用的實際意義，因此在工業生產中都利用微生物來進行該酶的生產。2.2 微生物產生纖維素酶的特點細菌生產的纖維素酶的活力較低，并多數不能分泌到細胞外。在細菌中，目前對生產高溫纖維素酶的耐熱梭狀芽胞桿菌和作為基因工程菌的大腸桿菌產生纖維素酶研究較多。絲狀真菌具有產酶的諸多優點:產生的纖維素酶為胞外酶，便于酶的分離和純化；產酶效率高，且產生的纖維素酶酶系結構較為合理，酶之間有強烈的協同作用；同時可產生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。從纖維素酶的工業化制備及其應用的角度，研究和采用絲狀真菌產酶具有更大的

8、意義。絲狀真菌中，酶活力較強的菌種為木霉、曲霉、根霉和青霉等。從目前的研究進展來看，由于里氏木霉 Rut C30和 QM 9414 同時具有較為穩定的性狀、優質高產纖維素酶的能力和較好的“抗代謝阻遏”能力，因此，它們被認為是最具有工業應用價值的菌株6。3 纖維素酶的生產工藝3.1 發酵制備纖維素酶纖維素酶是誘導酶，發酵過程中纖維素酶的大量合成必須有誘導物的作用。纖維素、纖維低聚糖及其他結構類似物均可作為纖維素酶的誘導物。因此，用于纖維素酶發酵制備的培養基，首先必須加入這些物質。為降低成本，簡化誘導物的制備工藝，通常采用富含這些物質的原料(包括植物纖維原料、各種酒糟、乳糖、淀粉水解糖等)作碳源，

9、使產酶過程中充當碳源的物質同時起著誘導物的作用。除碳源外，還要加入適當的氮源，同時注意碳氮比的合理搭配，因為低碳氮比將導致培養初期菌體的過快生長和對碳源消耗過快，高碳氮比將由于氮源不足而出現菌生長繁殖太慢。纖維素酶的生產可采用固態發酵或液體深層發酵兩種工藝。固態發酵法具有投資少、工藝簡單、價格低廉等優點，然而固體發酵法存在很大的缺陷，以秸稈為原料的固體發酵法生產的纖維素酶很難提取、精制，而且此法所產生的酶制劑外觀粗糙且質量不穩定，生產效率較低，易污染雜菌，不適于大規模生產。液體發酵生產時，將原料送入發酵罐內發酵，同時接入纖維素酶菌種。發酵過程中，需要從發酵罐底部通入無菌空氣對物料進行氣流攪拌，

10、發酵完后的物料經過處理可得到纖維素酶產品。液體發酵雖有發酵動力消耗大、設備要求高等缺點，但液體發酵對原料的利用率高、生產條件易于控制、產量高、工人勞動強度小、產品質量穩定，可大規模生產。因此，目前此方法是大規模生產的可行方法。其生產流程圖5如圖1所示：圖1 典型液體深層發酵纖維素酶生產工藝流程圖3.2 纖維素酶的分離純化粗纖維素酶液的提純可采用蛋白質提純的常用技術，包括熱失活分離提純法、分級沉淀法、層析法、離子交換法和超濾法等。工業上用于生產纖維素酶的粗酶制劑常采用硫酸按鹽析法、酒精沉淀法、丹寧沉淀法和離心噴霧干燥法等方法。4 利用纖維素酶生產燃料酒精加入纖維素酶，利用纖維素原料生產燃料酒精，

11、能解決能源危機、環境污染和資源浪費問題。工業上利用纖維素原料生產酒精的工藝流程如下：酸或酶 酵母 纖維素原料預處理水解糖化酒精發酵酒精4.1 纖維素原料的預處理方法在進行酶解前對木質纖維素進行預處理，可以破壞其結晶結構，提高酶的結合性和催化水解率。目前，物理方法預處理已研究的有機械粉碎、高壓熱水預處理、蒸汽爆碎處理、微波照射和輻射處理等。傳統的物理處理等方法不僅耗能較多，而且不同程度的存在環境污染，難以在大規模工業化生產中應用。而常用的化學預處理方法有酸法預處理和堿法預處理等。4.2 水解糖化過程及發酵產生酒精在水解糖化過程中，可以用酸或者纖維素酶進行，但是酸水解過程要求容器是防腐蝕、耐酸、耐

12、壓的，容器體積也較大。另外，酸水解常會伴隨生成有毒產物乳糖醛、酚類等物質，需要改善工藝，減少這些物質的產生。酶水解產率高，而且副產物很少，對于進一步的乙醇發酵減輕了提純的工作量，具有更好的應用價值。加入纖維素酶后，纖維素首先被纖維素酶Cl和Cx分解為纖維二糖，然后由-葡糖苷酶將纖維二糖分解為葡萄糖，葡萄糖由酵母發酵生成乙醇，反應式如下:C1-Cx -葡萄糖苷酶 酵母 纖維素纖維二糖葡萄糖酒精葡萄糖對-葡糖苷酶有阻礙作用，纖維二糖對C1-Cx有阻礙作用，隨著發酵的進行，葡萄糖不斷為酵母所利用，這些阻礙作用就會逐漸降低，纖維素在纖維素酶作用下不斷生成葡萄糖，為酵母作用生成酒精。但是，纖維素的酶解需

13、要大量的纖維素酶，而且酶的成本很高。因此工業化利用纖維素酶生產酒精還需要尋求廉價多產的酶源。5 纖維素酶研究的技術進展5.1產酶菌株的選育及誘變育種利用物理、化學誘變劑單獨或復合處理微生物細胞或孢子是選育高產突變種行之有效的方法，至今仍是育種的有效方法之一。崔福綿等從生霉棉布上分離出的康氏術霉CP88105經加熱和亞硝基胍處理后，獲得一株高產突變株CP88329。在固體培養基上28培養72h，所產纖維素酶復合物具有高的酶活力，產酶活力水平均為出發菌株的3倍。在用纖維素類原料發酵酒精方面，韓如等利用纖維素粘附厭氧滾管的方法得到了直接轉化纖維素產乙醇的菌株Clostridium sp.EVA4，用

14、1%纖維素濾紙培養120h后，該菌株產乙醇濃度為1123mg/L，纖維素降解率為59%。5.2重組DNA技術用基因工程技術構建含纖維素酶基因的克隆菌株，表達具有較高酶活力的纖維素酶。如Kondo等將帶有葡萄糖糖化酶基因的表達質粒pGA11導入酵母菌宿主YF207中，得到的菌株YF207/pGA11可在超過300h的條件下連續高產酒精且濃度達150g/L；能快速有效利用纖維二糖高產酒精的重組菌(Klebsiella oxytocaP2)，在利用10%葡萄糖和10%纖維二糖發酵產乙醇時，乙醇得率達到理論得率的96%以上；通過基因工程手段將相應的水解酶基因轉移到Z.mobilis中，使得該菌株能夠利

15、用木糖、甘露糖、乳糖甚至淀粉、纖維素等多種碳源；早在1986年，Pina，Calderon通過原生質體融合法，將發酵結合酵母菌株與釀酒酵母進行屬間融合，前者有可利用纖維質物質，耐高溫的特性，融合子具有雙親特性，可利用乳酸與纖維質原料做碳源制酒，性能穩定。在生產酒精行業中，還必須培育出耐高糖、高滲而又有較高發酵能力的酵母用于生產。6.利用纖維素酶生產酒精的發展前景6.1進一步選育高產復合酶系菌株由于纖維素酶是復合酶系，目前發現主要以上述3種成分為主，但是實際應用中對纖維素的分解仍然不徹底，尤其是對天然纖維素原料。再則由于自然界中的菌株產酶性能不高、各菌株酶組分活性各異、且存在某種特定組分酶活性較

16、低的缺陷。所以目前資料中報道的所 選育出來的菌種應用于生產還不是很理想。有待進一步篩選出產酶更高、更全面的菌株。通過把握不同菌種采用不同誘變光的強度、照射時間等處理條件，發現更好的、更理想的方法來實現提高菌株產酶。6.2纖維素酶分子水平研究得到突破基因工程技術已用來克隆、表達具有較高酶活的纖維素酶。由于纖維素水解需要多種酶成分的協同作用，而目前基因工程纖維素酶功能單薄，不足以徹底降解纖維素。因此，以后的基因工程纖維素酶既要克服木質素、木聚糖的障礙，又能克服反饋抑制作用。利用釀酒酵母具有把葡萄糖轉化為酒精的能力，將3類主要纖維素酶基因導入釀酒酵母，實現纖維素直接轉化生產酒精，還可生產SCP、多糖

17、等產品。但是，要獲取具有全纖維素酶的高產菌株，原生質體融合技術是理想的育種途徑。它可打破物種間細胞不能相互融合的障礙。通過細胞融合，就能獲得既能分解纖維素，又能分解木質素的穩定的雜種菌株，構建具有纖維素分解能力的釀酒酵母菌也勢在必得。6.3工程菌技術條件的進一步成熟含纖維素原料的酶解糖化與酒精發酵在同一反應器中連續進行時，除了消除葡萄糖因濃度高對纖維素酶的反饋抑制，還要協調酶水解與酵母發酵的最適溫度pH值、發酵特性等指標。同時以后成熟的工程菌會有3個顯著特性:一是能提高酒精對糖的收率，以降低酒精生產的原料消耗；二是具有一定的耐溫性，以提高發酵溫度，降低大型發酵裝置夏季高溫季節的冷卻費用；三是具

18、有很強的耐酒精性能，以提高發酵終點發酵液中的酒精濃度。7 展望生物多樣性與人類生存密切相關已為人們所共識。由于微生物的多樣性、傳代生長速度快、培養可控性、生產成本低、易進行基因突變、克隆重組及高效表達等優點，使人類能很快獲得優良的基因工程菌，微生物酶源無疑將會發揮更大的作用和潛力。相信在不久的將來極有可能直接以纖維素為原料制取酒精，從而從根本上變革傳統的酒精生產工藝。盡管纖維素作為直接碳源進行的研究還處于初級階段，但從目前的研究結果和發展趨勢來看，纖維素酒精發酵對我們已不遙遠。參考文獻：1 劉春芬,賀稚非,蒲海燕,等.纖維素酶及應用現狀J.糧食與油脂,2004,(1):15-17.2 王巧蘭,

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20、bacterial and fungal cellulases. Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides,1995,618:113-141.8 Himmel, M E, Adney W S, Baker J O, et al. Advanced bioethanol production technologies:A perspective. Fuels and Chemicals from Biomass,1997,666:2-45.9 高培基,曲音波,王祖農.纖維素酶解過程的分析和測定J.生物工程學報,1988,4(4):324.10 謝占玲, 吳潤.纖維素酶的研究進展J.草業科學,2004(4):72-76.11 徐學萬,張芳.纖維素酶的特性及其在食品工業中的應用J.糧食與食品工業,