1、蛋清蛋白酶解物的抗氧化、抗凝血酶活性及生化特性的研究楊萬根,張煜,王璋,許時嬰(江南大學食品學院,江蘇無錫214122摘要:研究了蛋清蛋白酶解物可能具有的抗氧化和抗凝血酶活性。水解用酶為Alcalase2.4L 堿性蛋白酶和Pro-teaseN 蛋白酶;測定了4個水解度的酶解物(采用pH-stat 法控制反應終點而得到的抗氧化和抗凝血酶活性,分析了活性最高的酶解物的氨基酸組成和相對分子量分布。結果表明,ProteaseN 蛋白酶的酶解物活性要高于Alcalase 酶解物,在水解度為15%時抗凝血酶活性最高;兩種來源的、水解度為15%的酶解物的7種必需氨基酸質量分數分別達到了48.11%與45.

2、80%,遠高于天然蛋清的7種必需氨基酸質量分數35.65%,說明兩種酶解物具有很高的營養價值。相對分子量分布顯示兩種酶解物(水解度為15%的多肽組成相似,因此活性的差異可能是因水解酶種類不同而導致的產物多肽的氨基酸序列不同的緣故。關鍵詞:蛋清;酶解物;活性肽;抗氧化;抗凝血酶StudyonAntioxidantandAntithrombinAcitivitiesofEggWhiteProteinHydrolysatesandTheirBiochemicalPropertiesYANGWan-gen,ZHANGYu,WANGZhang,XUShi-ying(SchoolofFoodScience

3、andTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,ChinaAbstract :Theantioxidantandantithrombinpropertiesofeggwhiteproteinhydrolysateswerestudiedinthisexperiment.Four hydrolysateswithdifferentdegreesofhydrolysis(DHwereobtainedusingAlcalase2.4LandProteaseNbypH-statmethod.Theantioxidantandantithrombinpropert

4、iesofhydrolysatesweredetermined.Also,theaminoacidcompositionandthemolecular weightdistributionofhydrolysateswiththehighestactivitieswereanalyzed.TheresultsshowedthattheactivitiesofProtease NhydrolysatesarehigherthanthoseofAlcalasehydrolysates,withthehydrolysate(DH15%havingthehighestantithrombin acti

5、vity.Theaminoacidsanalysisresultsshowedthatthecontentsofsevenessentialaminoacidsintwokindsofhydrolysates withDH15%are48.11%and45.80%,respectively,muchhigherthanthecontent35.65%ofnativeeggwhiteproteins.Molecular weightdistributionanalysisresultsshowedthatthetwohydrolysateswithDH15%havesimilarpeptides

6、compositions.The differenceonactivitiesisduetoenzymespeciesusedinthehydrolysisforproducingpeptideswithdifferentaminoacidsequences.Keywords :eggwhite ;hydrolysates ;biologicalpeptides ;antioxidant ;antithrombin中圖分類號:TS936.16文獻標識碼:A文章編號:1002-6630(200806-0202-06收稿日期:2007-07-06自由基會引起機體損傷變性,是機體的衰老、癌變、肺氣腫

7、、糖尿病等一系列自由基疾病的病源。機體中存在著一些抗氧化物質,它們具有預防這些疾病發生的作用1。在自由基疾病病人的營養中,補充一些抗氧化物質也能起到控制病情的作用。化學抗氧化劑因為毒、副作用正逐步受到限制,因此低價、高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開發成為研究熱點。活性肽具有多種生理活性,其中抗氧化肽能有效地清除體內過剩的活性氧自由基,保護細胞和線粒體的正常結構和功能,防止脂質過氧化的發生,在預防和治療自由基誘發的疾病和抗衰老方面有廣泛的應用前景。凝血酶是心血管疾病的重要作用因子,抗凝血酶肽在心血管疾病預防和治療中有重要作用2。我國蛋品資源豐富,蛋清的利用有待開發3。蛋清蛋白酶解產物是蛋清蛋白經

8、蛋白酶水解后生成的多肽和氨基酸的混合物,多肽的生理活性取決于多肽的相對分子質量大小和氨基酸序列,而多肽的相對分子質量大小和氨基酸序列又與蛋白質水解所用的蛋白酶種類和控制的水解度大小有關系。本實驗選用Alcalase2.4L堿性蛋白酶和ProteaseN蛋白酶水解蛋清蛋白,采用pH-stat法控制反應終點得到不同水解度的酶解物,分別考察這些酶解物的抗氧化和抗凝血酶活性,并分析酶解物的生化性質,為開拓蛋清利用新領域提供依據。1材料與方法1.1材料、試劑與儀器凍干蛋清粉。ProteaseN蛋白酶Amano酶制劑公司;Alcalase 2.4L堿性蛋白酶Novo酶制劑公司;凝血酶、纖維蛋白原、二苯基苦

9、基苯肼(DPPH,分析純Sigma公司;鄰苯三酚(分析純、鄰二氮菲(分析純中國醫藥(集團上海化學試劑公司;三羥甲基氨基甲烷(生化純國藥集團化學試劑有限公司;二硫蘇糖醇(D T T,生化純 M e r c k公司。722型分光光度計上海精密科學儀器有限公司; RE-52旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;Plus384酶標儀美國MolecularDevices公司;Agilent1100液相色譜儀美國安捷倫公司;4K15冷凍離心機美國Sigma公司;77585-306L落地式凍干機美國Labconco公司。1.2方法在磁力攪拌器攪拌下,配3L蛋白質濃度為4%(W/ W的蛋清粉溶液,用1N的NaOH或H

10、Cl調pH至10.0,迅速升溫至85后保溫變性30m i n。冷卻至反應溫度后,用1N的H C l調節至反應p H值。酶的反應p H和溫度分別是:ProteaseN蛋白酶:pH7.0,55;Alcalase 蛋白酶:p H8.0,60。按3%(W/W,酶/底物蛋白質(ProteaseN或0.1ml/100ml溶液(Alcalase2.4L的加酶量開始反應。根據pH-stat法,在反應過程中加入1N 的標準N a O H維持反應液的p H不變,通過調節加堿量控制反應的水解度。到達預定的水解度后,在沸水浴中保持15min,冷卻。100000×g離心,上清液旋轉蒸發濃縮,冷凍干燥得到酶解物

11、。根據pH-stat方法4,如式(1計算DH。DH(%=B×N b×1/×1/MP×1/h tot×100(1式中,B為耗堿量(ml;N b為堿的摩爾濃度(mol/ L;為-氨基的平均離解度;MP為蛋白質質量(g;生產過程中堿的加入使酶解物中鹽類物質增加,這些鹽類會影響到生理活性測定實驗結果,因此需要脫鹽5。具體步驟如下:用無水乙醇預處理DA201-C大孔吸附樹脂,洗至無酒精后裝柱,上樣,用紫外檢測器在220n m波長下檢測,靈敏度0.5,當流出液的O D值超過5時,停止上樣,改用去離子水脫鹽,直到洗脫液的電導率與去離子水一致。換用75%酒精洗

12、脫樹脂至OD值5以下,將洗脫液旋轉蒸發濃縮,然后冷凍干燥,得到脫鹽水解產物。采用Lowery法6。將酶解物溶解在6mol/L鹽酸中,110水解24h,蒸干鹽酸,定容得水解液。采用Agilent1100高效液相分析儀分析水解液中氨基酸組成。高效液相色譜儀條件:色譜柱為C18柱(4.0×125mm;柱溫為40;流速為1.0ml/ min;檢測波長為338、262n m(蛋白質;流動相A為20mmol醋酸鈉液,B為20mmol醋酸鈉液-甲醇-乙腈(1: 2:2,V/V/V。酶解物溶液經0.45m微孔過濾膜過濾后上TSKgel 2000色譜柱,以細胞色素C(M W12500、抑肽酶(M W

13、6500、桿菌酶(MW1450、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189為標準品,測定酶解物的相對分子量分布。高效液相色譜儀條件:Waters600(配2487紫外檢測器和M32工作站;色譜柱為TSKgel2000SWXL(300×7.8mm;流動相為乙腈-水-三氟乙酸(45:55:0.1,V/V/V;檢測波長為220nm;流速為0.5ml/min;柱溫為30。(1不同DH的蛋清酶解物對DPPH自由基的清除作用7準確稱取10m gD P P H用無水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中,則DPPH濃度為0.1mmol/L,避光保存。將2ml5mg/

14、ml樣品及2mlDPPH溶液加入同一試管中,搖勻,放置30m i n后用溶劑作參比測定其吸光度A t,同時測定DPPH溶液與2ml溶劑混合后的吸光度A c,以及2ml5mg/ml樣品與2ml溶劑混合后的吸光度A b。按照式(2計算清除率,清除率越大抗氧化能力越強。以抗壞血酸(VC作陽性對照物。A t-A bDPPH自由基清除率(%=(1-×100(2A c(2不同DH 的蛋清酶解物對羥自由基的清除作用8A 樣品-A 損傷羥自由基清除率(%=×100(3A 未損傷-A 損傷(3不同DH 的蛋清酶解物對超氧自由基的清除作用9按表1測定各個吸光度,樣品濃度25mg/ml。反應在2

15、5恒溫水浴中進行,加入鄰苯三酚引發反應,準確反應10min,加入30l100mmol/L 的DTT 終止反應,記錄1h 內325nm 處的吸光度(A,以A 2作對照測定A 1,以A 4作對照測定A 3。以抗壞血酸(VC作陽性對照物。按式(4計算各樣品清除率。A 3-A 4超氧自由基清除率(%=(1-×100(4A 1-A 2酶標儀的測定溫度設定為37,測定波長為405nm,測定時間10min,每隔30s 讀一次數。反應底物為0.1%的pH7.4的纖維蛋白原溶液。用含0.12mmol NaCl的0.05mol/LTris-HCl(pH7.4緩沖液溶解樣品、纖維蛋白原和凝血酶。往酶標板的

16、小井中依次加入40l 90mg/ml 樣品和140l0.1%纖維蛋白原溶液,振蕩混勻,然后加入10l12U/ml 的標準凝血酶溶液,振蕩混勻,開始讀數。選取動力學曲線中前后差值恒定的點為反應終點,采用式(5和(6計算酶解物對凝血酶的抑制率和抑制活性。A e -A iY=×100%(5A e -A o組號pH8.2050mmol/L 1mmol/LEDTA 去離子水(ml樣品(ml0.2mmol/L鄰苯三酚Tris-HCl緩沖液(ml水溶液(ml(用10mmol/LHCl 溶液配制,ml1.01.00.41.0表1超氧自由基的測定方法Table 1 Measurement method

17、 of superoxide radical-scavenging activityC eYV ei =(6V i C i數據處理采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析,用SNK 分析水解度間差異的顯著性,顯著性為p <0.05%。2結果與分析對D P P H 自由基的清除能力圖1酶解物對DPPH 自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of hydrolysates on DPPH free radical504540355101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物D P P H 自由基清除率(%水解度(%不同水解度的酶解物對DPPH 自由基

18、的清除作用見圖1。從圖1中可以看出,所有酶解物都具有清除DPPH 自由基的活性,但水解度相同時,ProteaseN 酶解物比Alcalase 酶解物具有更高的活性。ProteaseN 酶解物的活性隨D H 增加而增加,在D H 為20%時達到最高為48.27%±0.37%,超過陽性對照物VC 的47.59%±0.39%。Alcalase 酶解物的活性在DH 為10%時達到最大,為36.16%±0.75%。不同水解度的ProteaseN 酶解物它對羥自由基的清除能力對超氧自由基的清除能力不同水解度的酶解物對超氧自由基的清除作用見圖3。從圖3中看出,酶解物具有較高的清

19、除超氧自由基活性,兩種酶解物在D H 為10%以后活性增加緩慢,甚至P r o t e a s e N 酶解物的活性在D H 為15%后下降。Alcalase和ProteaseN酶解物的最大活性點分別是DH為20%時的79.66%±1.12%和DH 為15%時的82.39%±0.88%,而陽性對照值是63.35%±0.76%。ProteaseN 的不同水解度的酶解物的超氧自由基清除能力存在顯著差異,而Alcalase 酶解物在DH 為15%和DH 為20%之間無顯著差異,其他水解度的酶解物之間存在顯著差異。2.2酶解物的抗凝血酶活性酶解物的抗凝血酶活性見圖4。從圖

20、4看出,Alcalase 酶解物的抗凝血酶活性隨DH 增加,DH 為20%時,Alcalase酶解物的活性最大點為11.04±0.21ATU/g pro。ProteaseN 酶解物的活性從DH 為5%開始增加,D H 為15%時達到最大,在D H 為20%時又減小,最大時的抗凝血酶活性為19.885±0.48ATU/gpro。不同水解度酶解物之間活性均差異顯著。圖3酶解物對超氧自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effect of hydrolysates on superoxide radical80706050405101520Alcalase酶解物Pro

21、teaseN酶解物超氧自由基清除率(%水解度(%圖4不同DH 酶解物的抗凝血酶活性Fig.4 Antithrombin activities of hydrolysates with different DHs201510505101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物抗凝血酶活性(A T U /g p r o 水解度(%2.3氨基酸組成天然蛋清及其ProteaseN蛋白酶的酶解物(DH為5%與Alcalase(DH 為15%酶解物的氨基酸組成分析結果見表2。從表2可知,ProteaseN 和Alcalase 酶解物的氨基酸組成相似,其中天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、亮氨酸的質量

22、分數比較高,分別是9.43%與10.89%、11.28%與13.56%、10.41%與12.35%、12.25%與10.28%。兩種酶解物的7種必需氨基酸質量分數分別達到了48.11%與45.80%,遠高于天然蛋清的7種必需氨基酸質量分數35.65%。由于這些氨基酸在人體不能合成或合成的速度不能滿足機體的需要,必須由食物蛋白供給,因此這兩種酶解物具有很高的營養價值。遲玉杰等用大鼠喂養實驗證明蛋清蛋白酶解物的營養價值優于酪蛋白,消化利用率較高,是一種理想的氮源11。兩種酶解物的游離氨基酸組成分析結果見表3。可以看出,ProteaseN 的DH 為15%酶解物的游離氨基酸含量為4.193mg/gp

23、ro,小于Alcalase 的DH 為15%的酶解物的游離氨基酸含量(6.429mg/gpro。可能是因Alcalase 中含有少量外切酶引起。圖2酶解物對羥自由基的清除能力33305101520Alcalase酶解物ProteaseN酶解物羥自由基清除率(%水解度(%氨基酸游離氨基酸含量(mg/gpro4.1936.429表3酶解物的游離氨基酸組成Table 3 Free amino acid compositions of hydrolysates 圖5Protease N (DH 為15%酶解物的相對分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution of

24、hydrolysate prepared withProtease N (DH 15%5.003300A U時間(min21991415717260圖6Alcalase (DH 為15%酶解物的相對分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of hydrolysate prepared withAlcalase (DH 15%5.003300A U時間(min21991418736268峰編號相對分子質量分布(D各峰值的保留時間(min所占比例(%407219.00028.83362.24表4Protease N (DH 為15%酶解物的相對分子質量分布

25、及相對含量Table 4 Molecular weight distribution and relative content ofhydrolysate prepared with Protease N (DH 15%名稱相對分子質量分布(D各峰值的保留時間(min所占比例(%4113表5Alcalase (DH 為15%酶解物的相對分子質量分布及相對含量Table 5 Molecular weight distribution and relative content ofhydrolysate prepared with Alcalase (DH 15%2.4相對分子質量分布比例列于表4。可以看出,ProteaseN 的DH 為15%酶解物的相對分子質量分布在28638D 之間,其中數ProteaseN(DH為15%和Alcalase(DH 為15%酶解物的相對分子質量分布見圖5、6,它們分別由多種不同相對分子質量的組分組成。為了更好地描述各組分的分子大小,引入數均相對分子質量來描述各組分的平均相對分子質